Надежная визуализация фосфорилированных RIPK3 и MLKL, двух ключевых сигнальных событий во время индукции некроптоза, была технически сложной задачей. Представленный протокол амплификации тирамида позволяет чувствительно обнаруживать эти две молекулы. Шаг усиления сигнала снижает порог обнаружения, обеспечивая надежное и воспроизводимое обнаружение фосфорилированных RIPK3 и MLKL.
Начните посев 90 000 ZBP1-экспрессирующих клеток HT-29 в полноценную среду McCoy's 5A в пластину скважины площадью один сантиметр, что позволит проводить высококачественную микроскопию. Используйте конечный объем 200 микролитров на лунку. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.
Как только клетки достигают от 70 до 80% конфлюентности, заражают клетки в 200 микролитров предварительно нагретой, полной мощности среды Маккоя 5A, содержащей вирус простого герпеса один, кодирующий мутантный обод ICP6 при множественности инфекции в пять. Инкубируйте клетки с вирусом в течение девяти часов, чтобы вызвать некроптоз. В качестве положительного контроля индукции некроптоза стимулируйте клетки в течение четырех часов 200 микролитрами предварительно нагретого коктейля, вызывающего некроптоз.
В качестве отрицательного контроля добавьте 22 микролитра 10 микромоляров GSK840, предварительно нагретых при 37 градусах Цельсия, чтобы ингибировать активность киназы RIPK3. Включают этот ингибитор в необработанном состоянии и после стимуляции некроптоза для предотвращения аутофосфорилирования серина 227. Чтобы закрепить клетки, удалите среду и промыть клетки 200 микролитрами PBS.
Затем удалите PBS и добавьте 150 микролитров 4% параформальдегида, уравновешенного при комнатной температуре. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 30 минут. После фиксации удаляют 4% параформальдегида и трижды промывают клетки 200 микролитрами PBS.
Образцы могут храниться в количестве, превышающем PBS при четырех градусах Цельсия в течение ночи до дальнейшей обработки. Извлеките PBS из пластины и инкубируйте клетки со 100 микролитрами буфера проникновения при комнатной температуре в течение 30 минут на наклонном лабораторном шейкере. После инкубации удалите буфер пермеабилизации и промыть клетки 100 микролитрами промывочного буфера.
Инкубируйте камеру визуализации с буфером промывки в течение пяти минут при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание первичных антител, инкубируют пластину со 100 микролитрами блокирующей среды при комнатной температуре в течение двух часов на наклонном лабораторном шейкере. Далее промыть колодцы три раза 100 микролитрами промывочного буфера с пятью минутами инкубации при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
После удаления буфера промывки добавьте 100 микролитров первичных антител в камеру визуализации. Убедитесь, что у вас нет первичного антитела, чтобы визуализировать потенциальный фон усиления тирамидного сигнала и установить порог маскировки. Насиживайте камеру на ночь при четырех градусах Цельсия.
Удалите первичную смесь антител и трижды промыть лунки 100 микролитрами промывочного буфера с пятью минутами инкубации при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере. После удаления промывочного буфера инкубируют клетки со 100 микролитрами меченого HRP вторичного антитела, распознавая вид первичного антитела, подлежащего усилению в течение 30 минут на наклонном лабораторном шейкере. Во время инкубации антител готовят биотинилированную тирамидную смесь.
Чтобы вызвать ферментативную активность HRP, добавьте окисляющий субстрат в буфер TSA перед использованием. Затем разбавляют биотинилированный тирамид в подготовленном буфере TSA с использованием оптимизированного разбавления. После инкубации с меченым HRP вторичным антителом трижды промывайте колодцы промывочным буфером с пятью минутами инкубации на наклонном лабораторном шейкере.
После снятия промывочного буфера из скважины добавьте в скважину разбавленный биотин-тирамид до конечного объема 100 микролитров. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут на наклонном лабораторном шейкере с последующей тремя промывочными буферными промывками. Приготовьте окрашивающую смесь, содержащую вторичное антитело, связанный стрептавидин, а также буфер ядерного окрашивания и промывки.
Снимите буфер для стирки и инкубируйте пластину со 100 микролитрами окрашивающей смеси при комнатной температуре в течение одного часа на наклонном лабораторном шейкере. Держите камеры визуализации защищенными от света с этого шага вперед. После окрашивания дважды промывайте с помощью промывочного буфера и два раза промойте колодцы PBS.
Храните образцы сверх PBS при четырех градусах Цельсия, чтобы сохранить окрашивание до получения изображения. Камера визуализации теперь готова к визуализации на конфокальном микроскопе. Включение амплификации тирамидного сигнала позволило надежно обнаружить RIPK3, фосфорилированный при серине 227, в цитозоле вируса простого герпеса, кодирующего мутантные клетки ICP6.
Мощность лазера в 2% была достаточной для чувствительного обнаружения. При стандартной непрямой иммунофлуоресценции более высокая мощность лазера оставалась недостаточной для обнаружения фосфо-RIPK3. При количественной оценке трехмерных изображений Z-стека инфицированные клетки показали примерно 20-кратное увеличение вокселей, положительных для фосфорилированных RIPK3 по сравнению с клетками, обработанными имитацией.
Повышенное окрашивание фосфо-RIPK3 инфицированных клеток вирусом простого герпеса дикого типа по сравнению с клетками, обработанными имитацией, указывало на то, что кольцевой домен ICP6 не может полностью блокировать фосфорилирование RIPK3 при серине 227. GSK840 связывается с киназным доменом RIPK3 и предотвращает фосфорилирование RIPK3 при серине 227 при активации ZBP1, подтверждая специфичность метода обнаружения фосфо-RIPK3, опосредованного усилением тирамидного сигнала. Пробные обработанные клетки показали низкое слегка прерывистое цитозольное окрашивание фосфорилирования MLKL при серине 358, в то время как сильное окрашивание было обнаружено в цитозоле, ядре и плазматической мембране инфицированных клеток.
Стандартная непрямая иммунофлуоресценция требовала 40% мощности лазера для специфического обнаружения сигнала фосфо-МЛКЛ в инфицированных клетках. Напротив, усиление тирамидного сигнала повысило чувствительность обнаружения фосфо-МЛКЛ, тем самым снизив необходимую мощность лазера до 6%3D Z-стека, количественное определение изображения показало примерно 90-кратное увеличение числа вокселей положительных для фосфо-МЛКЛ с использованием тирамидного усиления сигнала по сравнению с семикратным увеличением с использованием стандартного метода, что указывает на улучшение порога обнаружения и чувствительности для фосфо-МЛКЛ. Подобно вирусу простого герпеса, вирусная инфекция гриппа А вызвала ZBP1-зависимый некроптоз.
Усиление тирамидного сигнала позволило надежно обнаружить фосфо-RIPK3 и фосфо-МЛКЛ, что указывает на некроптоз. Чтобы интерпретировать конфокальное окрашивание, необходимо включить несколько элементов управления окрашиванием. Это влечет за собой отсутствие первичного состояния, единичные пятна, а также положительный контроль.
Адаптируя этот протокол, несколько целей могут быть усилены с использованием последовательного TSA. Это позволило бы обнаруживать фосфорилированные RIPK3 и MLKL в одной клетке. Чувствительное обнаружение биомаркеров некроптоза может быть полезным для текущих исследований ZBP1 по аутовоспалению или вирусной инфекции, при которых выполненные ZBP1-зависимые пути гибели клеток все еще должны быть подтверждены как некроптоз, апоптоз или пироптоз.
