הדמיה חזקה של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחון, שני אירועי איתות מרכזיים במהלך אינדוקציה של נקרופטוזיס, הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. פרוטוקול ההגברה המוצג של טירמיד מאפשר זיהוי רגיש של שתי המולקולות הללו. שלב הגברת האות מוריד את סף הגילוי, ומאפשר זיהוי חזק וניתן לשחזור של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחן.
התחל לזרוע את 90, 000 תאי HT-29 המבטאים ZBP1 במלוא העוצמה של McCoy's 5A בצלחת באר שטח פנים מרובע של סנטימטר אחד, המאפשרת מיקרוסקופיה מתקדמת. השתמש בנפח סופי של 200 מיקרוליטר לבאר. לדגור על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%, מדביקים את התאים ב-200 מיקרוליטרים מחוממים מראש, בעוצמה מלאה של McCoy's 5A המכיל וירוס הרפס סימפלקס אחד, המקודד ICP6 מוטנטי חישוק בריבוי של זיהום של חמישה. לדגור על התאים עם הנגיף במשך תשע שעות כדי לגרום לנקרופטוזיס. כבקרה חיובית על אינדוקציה של נקרופטוזיס, עוררו את התאים במשך ארבע שעות עם 200 מיקרוליטרים של קוקטייל מעורר נקרופטוזיס שחומם מראש.
כבקרה שלילית, הוסף 22 מיקרוליטרים של 10 מיקרומולר GSK840 שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעכב את פעילות קינאז RIPK3. כלול מעכב זה במצב לא מטופל ולאחר גירוי נקרופטוזיס כדי למנוע את האוטופוספורילציה של סרין 227. כדי לתקן את התאים, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 200 microliters של PBS.
לאחר מכן להסיר את PBS ולהוסיף 150 microliters של 4% paraformaldehyde שיווי משקל בטמפרטורת החדר. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר קיבוע, להסיר את 4% paraformaldehyde, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS.
ניתן לאחסן את הדגימות עודף של PBS בארבע מעלות צלזיוס בן לילה עד להמשך העיבוד. מוציאים את ה-PBS מהצלחת, ודוגרים על התאים עם 100 מיקרוליטרים של חיץ חלחול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר מעבדה נוטה. לאחר הדגירה, להסיר את חיץ permeabilization, ולשטוף את התאים עם 100 microliters של חיץ לשטוף.
דגירה של תא ההדמיה עם מאגר שטיפה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה מוטה. כדי למנוע את הקשירה הלא ספציפית של נוגדנים ראשוניים, דגרו את הצלחת עם 100 מיקרוליטרים של מדיום חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעתיים על שייקר מעבדה מוטה. לאחר מכן, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 100 microliters של חיץ לשטוף עם חמש דקות של דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה הטיה.
לאחר הסרת מאגר הכביסה, הוסף 100 מיקרוליטרים של הנוגדנים העיקריים לתא ההדמיה. הקפידו לכלול מצב ללא נוגדנים ראשוני כדי לדמיין את הרקע הפוטנציאלי של הגברת אות הטירמיד, ולקבוע את סף המיסוך. לדגור את החדר במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את תערובת הנוגדנים העיקרית, ושטוף את הבארות שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של חיץ שטיפה עם חמש דקות של דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה הטיה. לאחר הסרת חיץ הכביסה, דגרו על התאים 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני עם תווית HRP, וזיהו את המין של הנוגדן הראשוני להיות מוגבר במשך 30 דקות על שייקר מעבדה הטיה. במהלך דגירה של נוגדנים, הכינו את תערובת הטירמידים הביוטינילציה.
כדי להפעיל את הפעילות האנזימטית של HRP, הוסף מצע מחמצן למאגר TSA טרי לפני השימוש. לאחר מכן דילל את הטירמיד הביוטינילי במאגר TSA המוכן באמצעות דילול אופטימלי. לאחר הדגירה עם נוגדן משני עם תווית HRP, יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם מאגר שטיפה עם חמש דקות של דגירה על שייקר מעבדה מוטה.
לאחר הסרת חיץ השטיפה מהבאר, הוסיפו ביוטין-טירמיד מדולל לבאר לנפח סופי של 100 מיקרוליטרים. דגירה של התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות על שייקר מעבדה הטיה, ולאחר מכן שלוש שטיפות חיץ שטיפה. הכינו את תערובת הכתמים המכילה את הנוגדן המשני, סטרפטווידין מצומד, וכתם גרעיני ומאגר כביסה.
מוציאים את חיץ הכביסה ודוגרים את הצלחת עם 100 מיקרוליטרים של תערובת כתמים בטמפרטורת החדר למשך שעה על שייקר מעבדה מוטה. שמור על תאי ההדמיה מוגנים מפני אור משלב זה ואילך. לאחר הצביעה, יש לשטוף פעמיים ברציפות עם חיץ כביסה, ולשטוף את הבארות פעמיים עם PBS.
אחסנו את הדגימות העולות על PBS בארבע מעלות צלזיוס כדי לשמר את הכתמים עד להדמיה. תא ההדמיה מוכן כעת להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי. הכללת הגברת אות הטירמיד אפשרה זיהוי חזק של זרחן RIPK3 בסרין 227 בציטוזול של נגיף הרפס סימפלקס אחד המקודד תאים נגועים ICP6 מוטציה חישוק.
עוצמת לייזר של 2% הספיקה לזיהוי רגיש. באימונופלואורסצנציה עקיפה סטנדרטית, עוצמת לייזר גבוהה יותר נותרה לא מספיקה לזיהוי פוספו-RIPK3. בכימות תמונות ה-Z-stack התלת-ממדיות, התאים הנגועים הראו עלייה של בערך פי 20 בווקסלים חיוביים ל-RIPK3 שעברו פוספורילציה על פני תאים שטופלו במדומה.
הכתמה מוגברת של פוספו-RIPK3 של נגיף הרפס סימפלקס מסוג בר, תאים נגועים בהשוואה לתאים שטופלו במדומה, הצביעה על כך שתחום החישוקים של ICP6 אינו מסוגל לחסום לחלוטין זרחון RIPK3 בסרין 227. GSK840 נקשר לתחום הקינאז של RIPK3, ומונע זרחון RIPK3 בסרין 227 עם הפעלת ZBP1, ומאשר את הספציפיות של שיטת זיהוי האות טירמיד בתיווך phospho-RIPK3. התאים שטופלו באופן מדומה הראו הכתמה ציטוזולית מעט מנוקבת של זרחון MLKL בסרין 358, בעוד שצביעה חזקה זוהתה בציטוזול, בגרעין ובקרום הפלזמה של התאים הנגועים.
האימונופלואורסצנציה העקיפה הסטנדרטית דרשה כוח לייזר של 40% לזיהוי ספציפי של אות פוספו-MLKL בתאים הנגועים. לעומת זאת, הגברת אות הטירמיד הגבירה את רגישות הזיהוי של phospho-MLKL, ובכך הורידה את עוצמת הלייזר הדרושה לכימות תמונה של 6% 3D Z-stack הראתה עלייה של פי 90 בערך במספר הווקסלים החיוביים עבור phospho-MLKL באמצעות הגברת אות טירמיד, בהשוואה לעלייה של פי שבעה בשיטה הסטנדרטית, מה שמצביע על סף זיהוי ורגישות משופרים עבור phospho-MLKL. בדומה לנגיף הרפס סימפלקס אחד, זיהום בנגיף שפעת A גרם לנקרופטוזיס תלוי ZBP1.
הגברת אות הטירמיד אפשרה זיהוי חזק של פוספו-RIPK3 ופוספו-MLKL, מה שמעיד על נקרופטוזיס. כדי לפרש את הכתם הקונפוקלי, יש לכלול מספר פקדי צביעה. זה כרוך במצב ראשוני לא, כתמים בודדים, כמו גם שליטה חיובית.
על ידי התאמת פרוטוקול זה, ניתן להגביר מטרות מרובות באמצעות TSA רציף. זה יאפשר זיהוי של RIPK3 זרחני ו- MLKL בתוך אותו תא. זיהוי רגיש של סמנים ביולוגיים של נקרופטוזיס יכול להיות תובנה למחקר מתמשך של ZBP1 על דלקת אוטומטית או זיהום בנגיף, שבו מסלולי המוות התאי התלויים ב-ZBP1 עדיין צריכים להיות מאושרים כנקרופטוזיס, אפופטוזיס או פירופטוזיס.
