La visualisation robuste de RIPK3 et MLKL phosphorylés, deux événements de signalisation clés lors de l’induction de la nécroptose, a été techniquement difficile. Le protocole d’amplification tyramide présenté permet une détection sensible de ces deux molécules. L’étape d’amplification du signal abaisse le seuil de détection, permettant une détection robuste et reproductible des RIPK3 et MLKL phosphorylés.
Commencez à ensemencer les 90 000 cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy pleine puissance dans une plaque de puits d’une surface carrée d’un centimètre, permettant une microscopie haut de gamme. Utilisez un volume final de 200 microlitres par puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Une fois que les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, infectez les cellules dans 200 microlitres préchauffés, milieu 5A de McCoy contenant le virus de l’herpès simplex un, codant un mutant de bord ICP6 à une multiplicité d’infection de cinq. Incuber les cellules avec le virus pendant neuf heures pour induire la nécroptose. Comme contrôle positif de l’induction de la nécroptose, stimulez les cellules pendant quatre heures avec 200 microlitres de cocktail préchauffé induisant la nécroptose.
Comme témoin négatif, ajoutez 22 microlitres de 10 micromolaires GSK840 préchauffés à 37 degrés Celsius pour inhiber l’activité de la kinase RIPK3. Inclure cet inhibiteur dans une condition non traitée et après la stimulation par nécroptose pour empêcher l’autophosphorylation de la sérine 227. Pour fixer les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec 200 microlitres de PBS.
Retirez ensuite le PBS et ajoutez 150 microlitres de paraformaldéhyde à 4% équilibré à température ambiante. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes. Après la fixation, retirez le paraformaldéhyde à 4% et lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS.
Les échantillons peuvent être conservés en excès de PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à un traitement ultérieur. Retirer le PBS de la plaque et incuber les cellules avec 100 microlitres de tampon de perméation à température ambiante pendant 30 minutes sur un agitateur de laboratoire basculant. Après l’incubation, retirez le tampon de perméabilisation et lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon de lavage.
Incuber la chambre d’imagerie avec un tampon de lavage pendant cinq minutes à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps primaires, incuber la plaque avec 100 microlitres de milieu bloquant à température ambiante pendant deux heures sur un agitateur de laboratoire basculant. Ensuite, lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
Après avoir retiré le tampon de lavage, ajoutez 100 microlitres d’anticorps primaires dans la chambre d’imagerie. Assurez-vous d’inclure une condition d’absence d’anticorps primaire pour visualiser le fond potentiel de l’amplification du signal tyramide et pour définir le seuil de masquage. Incuber la chambre pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Retirez le mélange d’anticorps primaires et lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. Après avoir retiré le tampon de lavage, incuber les cellules avec 100 microlitres d’anticorps secondaire marqué HRP, en reconnaissant l’espèce de l’anticorps primaire à amplifier pendant 30 minutes sur un agitateur de laboratoire inclinable. Pendant l’incubation des anticorps, préparer le mélange de tyramide biotinylé.
Pour déclencher l’activité enzymatique du HRP, ajouter un substrat oxydant au tampon TSA fraîchement avant utilisation. Diluer ensuite le tyramide biotinylé dans le tampon TSA préparé en utilisant la dilution optimisée. Après l’incubation avec un anticorps secondaire marqué HRP, laver les puits trois fois avec un tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation sur un agitateur de laboratoire basculant.
Après avoir retiré le tampon de lavage du puits, ajouter de la biotine-tyramide diluée au puits jusqu’à un volume final de 100 microlitres. Incuber la réaction à température ambiante pendant 10 minutes sur un agitateur de laboratoire basculant, suivi de trois lavages tampons de lavage. Préparer le mélange de coloration contenant l’anticorps secondaire, la streptavidine couplée et la coloration nucléaire et le tampon de lavage.
Retirez le tampon de lavage et incuber la plaque avec 100 microlitres de mélange de coloration à température ambiante pendant une heure sur un agitateur de laboratoire basculant. Gardez les chambres d’imagerie à l’abri de la lumière à partir de cette étape. Après la coloration, laver deux fois consécutivement avec un tampon de lavage et rincer les puits deux fois avec du PBS.
Conservez les échantillons en excès de PBS à quatre degrés Celsius pour préserver la coloration jusqu’à l’imagerie. La chambre d’imagerie est maintenant prête à être visualisée au microscope confocal. L’inclusion de l’amplification du signal tyramide a permis la détection robuste de RIPK3 phosphorylé à la sérine 227 dans le cytosol du virus de l’herpès simplex un codant pour une mutant de bord ICP6 cellules infectées.
Une puissance laser de 2% était suffisante pour la détection sensible. Dans l’immunofluorescence indirecte standard, une puissance laser plus élevée est restée insuffisante pour la détection du phospho-RIPK3. Dans la quantification des images tridimensionnelles de la pile Z, les cellules infectées ont montré une augmentation d’environ 20 fois des voxels positifs pour RIPK3 phosphorylé par rapport aux cellules simulées traitées.
L’augmentation de la coloration phospho-RIPK3 des cellules infectées par le virus de l’herpès simplex de type sauvage par rapport aux cellules simulées a indiqué que le domaine de bord de l’ICP6 est incapable de bloquer complètement la phosphorylation de RIPK3 à la sérine 227. GSK840 se lie au domaine kinase de RIPK3 et empêche la phosphorylation de RIPK3 à la sérine 227 lors de l’activation de ZBP1, confirmant la spécificité de la méthode de détection phospho-RIPK3 médiée par l’amplification du signal tyramide. Les cellules simulées traitées ont montré une coloration cytosolique faible en légère ponctuation de la phosphorylation MLKL à la sérine 358, tandis qu’une forte coloration a été détectée dans le cytosol, le noyau et la membrane plasmique des cellules infectées.
L’immunofluorescence indirecte standard nécessitait une puissance laser de 40% pour la détection spécifique d’un signal phospho-MLKL dans les cellules infectées. En revanche, l’amplification du signal tyramide a augmenté la sensibilité de détection du phospho-MLKL, abaissant ainsi la puissance laser nécessaire à 6%La quantification de l’image Z-stack 3D a montré une augmentation d’environ 90 fois du nombre de voxels positifs pour phospho-MLKL en utilisant l’amplification du signal tyramide, par rapport à une multiplication par sept avec la méthode standard, indiquant une amélioration du seuil de détection et de la sensibilité pour phospho-MLKL. Semblable au virus de l’herpès simplex un, l’infection par le virus de la grippe A a déclenché une nécroptose dépendante de ZBP1.
L’amplification du signal tyramide a permis la détection robuste de phospho-RIPK3 et phospho-MLKL, indiquant une nécroptose. Pour interpréter la coloration confocale, plusieurs contrôles de coloration doivent être inclus. Cela implique une condition non primaire, des taches uniques, ainsi qu’un contrôle positif.
En adaptant ce protocole, plusieurs cibles peuvent être amplifiées à l’aide de TSA séquentielle. Cela permettrait la détection de RIPK3 et MLKL phosphorylés dans la même cellule. La détection sensible des biomarqueurs de la nécroptose peut être utile pour la recherche ZBP1 en cours sur l’auto-inflammation ou l’infection virale dans laquelle les voies de mort cellulaire dépendantes de ZBP1 exécutées doivent encore être confirmées comme nécroptose, apoptose ou pyroptose.
