كان التصور القوي ل RIPK3 و MLKL المفسفرين ، وهما حدثان رئيسيان للإشارة أثناء تحريض التنخر ، تحديا تقنيا. يتيح بروتوكول تضخيم التيراميد المقدم الكشف الحساس عن هذين الجزيئين. تعمل خطوة تضخيم الإشارة على خفض عتبة الكشف ، مما يسمح بالكشف القوي والقابل للتكرار عن RIPK3 و MLKL المفسفر.
ابدأ في بذر 90،000 خلية HBP1 معبرة عن HT-29 في وسط McCoy 5A كامل القوة في لوحة بئر بمساحة سطح مربعة واحدة ، مما يسمح بإجراء الفحص المجهري المتطور. استخدم حجما نهائيا يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بمجرد أن تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من التقاء، تصيب الخلايا في 200 ميكرولتر مسخن مسبقا، كامل القوة مكوي 5A المتوسطة التي تحتوي على فيروس الهربس البسيط واحد، ترميز حافة متحولة ICP6 في تعدد العدوى من خمسة. احتضان الخلايا مع الفيروس لمدة تسع ساعات للحث على التنخر. كعنصر تحكم إيجابي في تحريض التنخر ، قم بتحفيز الخلايا لمدة أربع ساعات باستخدام 200 ميكرولتر من الكوكتيل المسخن مسبقا الذي يسبب التنخر.
كعنصر تحكم سلبي ، أضف 22 ميكرولتر من 10 ميكرومولار GSK840 مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية لمنع نشاط كيناز RIPK3. قم بتضمين هذا المانع في حالة غير معالجة وبعد تحفيز التنخر لمنع الفسفرة الذاتية لسيرين 227. لإصلاح الخلايا ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
ثم قم بإزالة PBS وإضافة 150 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد متوازن في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت ، قم بإزالة 4٪ بارافورمالدهيد ، واغسل الخلايا ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من PBS.
يمكن تخزين العينات بما يزيد عن PBS عند أربع درجات مئوية طوال الليل حتى مزيد من المعالجة. قم بإزالة PBS من اللوحة ، واحتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر مختبر مائل. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية ، واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
احتضان غرفة التصوير مع مخزن الغسيل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل. لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الأولية ، احتضن اللوحة ب 100 ميكرولتر من وسط الحجب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على شاكر مختبر مائل. بعد ذلك ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الغسيل مع خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى غرفة التصوير. تأكد من تضمين حالة عدم وجود جسم مضاد أولي لتصور الخلفية المحتملة لتضخيم إشارة التيراميد ، وتعيين عتبة التقنيع. احتضان الغرفة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الأساسي ، واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الغسيل مع خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل. بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل ، قم باحتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP ، مع التعرف على أنواع الجسم المضاد الأساسي المراد تضخيمه لمدة 30 دقيقة على شاكر مختبر مائل. أثناء حضانة الأجسام المضادة ، قم بإعداد مزيج تيراميد البيوتينيل.
لتحفيز النشاط الأنزيمي ل HRP ، أضف ركيزة مؤكسدة إلى المخزن المؤقت TSA طازجا قبل الاستخدام. ثم قم بتخفيف التيراميد البيوتينيل في المخزن المؤقت TSA المحضر باستخدام التخفيف الأمثل. بعد الحضانة بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة HRP ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام عازل الغسيل مع خمس دقائق من الحضانة على شاكر مختبر مائل.
بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل من البئر ، أضف البيوتين تيراميد المخفف إلى البئر إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على شاكر مختبر مائل ، متبوعا بثلاث غسلات عازلة للغسيل. تحضير مزيج تلطيخ يحتوي على الجسم المضاد الثانوي ، والستربتافيدين إلى جانب ، والبقع النووية وغسل العازلة .
قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل واحتضان اللوحة ب 100 ميكرولتر من مزيج التلوين في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على شاكر مختبر مائل. حافظ على غرف التصوير محمية من الضوء من هذه الخطوة فصاعدا. بعد تلطيخ ، يغسل مرتين على التوالي مع غسل عازلة ، وشطف الآبار مرتين مع PBS.
قم بتخزين العينات التي تزيد عن PBS عند أربع درجات مئوية للحفاظ على التلوين حتى التصوير. غرفة التصوير جاهزة الآن للتصور على مجهر متحد البؤر. مكن تضمين تضخيم إشارة التيراميد من الكشف القوي عن RIPK3 المفسفر في سيرين 227 في السيتوسول لفيروس الهربس البسيط الأول الذي يشفر الخلايا المصابة ب ICP6 الطافرة الحافة.
كانت قوة الليزر بنسبة 2٪ كافية للكشف الحساس. في التألق المناعي غير المباشر القياسي ، ظلت طاقة الليزر الأعلى غير كافية للكشف عن الفوسفو-RIPK3. في القياس الكمي لصور Z-stack ثلاثية الأبعاد ، أظهرت الخلايا المصابة زيادة بمقدار 20 ضعفا تقريبا في voxels الإيجابية ل RIPK3 المفسفرة على الخلايا المعالجة الوهمية.
أشارت زيادة تلطيخ الفوسفو-RIPK3 لفيروس الهربس البسيط من النوع البري إلى خلايا مصابة بخلايا وهمية مقارنة بالخلايا المعالجة الوهمية إلى أن مجال حافة ICP6 غير قادر على منع فسفرة RIPK3 عند سيرين 227 تماما. يرتبط GSK840 بمجال كيناز RIPK3 ، ويمنع فسفرة RIPK3 عند سيرين 227 عند تنشيط ZBP1 ، مما يؤكد خصوصية طريقة الكشف عن phospho-RIPK3 بوساطة تضخيم إشارة التيراميد. أظهرت الخلايا المعالجة الوهمية انخفاضا في تلطيخ خلوي متقطع قليلا لفسفرة MLKL عند سيرين 358 ، بينما تم اكتشاف تلطيخ قوي في السيتوسول والنواة وغشاء البلازما للخلايا المصابة.
يتطلب التألق المناعي غير المباشر القياسي طاقة ليزر بنسبة 40٪ للكشف المحدد عن إشارة phospho-MLKL في الخلايا المصابة. في المقابل ، أدى تضخيم إشارة التيراميد إلى زيادة حساسية الكشف عن فوسفو-MLKL ، وبالتالي خفض طاقة الليزر اللازمة إلى 6٪ 3D أظهر القياس الكمي لصورة Z-stack زيادة بنحو 90 ضعفا في عدد الفوكسل الإيجابي لفوسفو-MLKL باستخدام تضخيم إشارة التيراميد ، مقارنة بزيادة سبعة أضعاف باستخدام الطريقة القياسية ، مما يشير إلى تحسين عتبة الكشف والحساسية لفوسفو-MLKL. على غرار فيروس الهربس البسيط الأول ، تسببت عدوى فيروس الأنفلونزا A في حدوث نخر يعتمد على ZBP1.
سمح تضخيم إشارة التيراميد بالكشف القوي عن phospho-RIPK3 و phospho-MLKL ، مما يشير إلى تنخر. لتفسير التلوين البؤري ، يجب تضمين العديد من عناصر التحكم في التلطيخ. هذا يستلزم عدم وجود حالة أساسية ، بقع واحدة ، بالإضافة إلى التحكم الإيجابي.
من خلال تكييف هذا البروتوكول ، يمكن تضخيم أهداف متعددة باستخدام TSA المتسلسل. هذا من شأنه أن يسمح بالكشف عن RIPK3 و MLKL المفسفرة داخل نفس الخلية. يمكن أن يكون الكشف الحساس عن المؤشرات الحيوية للنخر ثاقبا لأبحاث ZBP1 المستمرة حول الالتهاب الذاتي أو عدوى الفيروس التي لا تزال فيها مسارات موت الخلايا المعتمدة على ZBP1 المنفذة بحاجة إلى تأكيد إما على أنها تنخر أو موت الخلايا المبرمج أو بيروبتوسيس.
