（poro-）弹性收缩肌动球蛋白网络作为细胞骨架模型系统的机制

我们已经开发了一种体外方法来表征多孔弹性肌动肌肽凝胶的力学，作为细胞骨架的模型系统，更一般地说，细胞质已被证明表现为多孔弹性活性材料。该方法提供了肌球蛋白收缩性如何促进流体流动的出现以及网络和细胞质速度如何在时间和空间上相关的见解。这种简单的方法使我们能够提取动态演变系统的机械性能，而无需使用任何无法使用AFIM等传统工具的复杂设备或技术。

该方法可以深入了解多孔弹性活性材料的流变学，而不管活性凝胶和包埋流体的特异性如何。首先，将 10 到 12 个 1.5 号玻璃盖玻片放入自制的聚四氟乙烯支架中，并在 400 毫升烧杯中制备食人鱼溶液。在化学罩中的冰上制备溶液。

将支架转移到装满食人鱼的烧杯中。三个小时后，将支架转移到装有新鲜双蒸水的干净烧杯中，从盖玻片上洗涤多余的食人鱼，然后将烧杯转移到 80 赫兹的超声浴中，并在 25 摄氏度下全功率 10 分钟。用新鲜的双蒸水再重复此步骤两次。

对于盐碱化，将支架转移到装有300毫升纯甲醇的干净烧杯中，然后放入超声浴中30分钟。然后将支架转移到硅烷溶液中。用封口膜密封烧杯，并将其保存在冰箱中，温度为四摄氏度过夜。

第二天，将支架转移到装有 300 毫升纯甲醇的干净烧杯中 15 秒。干燥支架底部以去除多余的甲醇并将其转移到干净的烧杯中。然后将烧杯转移到烤箱中，在 120 摄氏度下将玻璃盖玻片干燥五分钟。

为了实现表面钝化，每个实验取两个盖玻片，并将它们放置在涂有最初用乙醇清洁的封口膜层的培养皿中。将每个盖玻片与一毫升甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺在 1X PBS 中在 22 摄氏度下孵育一小时。在孵育过程结束时，倾斜培养皿以取出并钉住。

用五毫升双蒸水冲洗每个盖玻片，并用氮气流干燥。由于盖玻片在钝化后必须保持湿润，因此立即将一毫升10毫摩尔Tris放在聚乙二醇化表面上，并在两小时内使用盖玻片。为了形成大的肌球蛋白聚集体，用10毫摩尔Tris稀释肌球蛋白储备溶液，以达到25毫摩尔氯化钾的最终浓度。

将稀释的肌球蛋白溶液在室温下保持10分钟，然后将其转移到冰上直至使用。电机完全启动长达两个小时。为了跟踪溶剂流过凝胶孔，制备钝化荧光珠，并通过将1微升珠子与5微摩尔G-肌动蛋白孵育20分钟来减少磁珠与肌动蛋白网络之间的相互作用。

通过离心去除多余的G-肌动蛋白。用每毫升10毫克的牛血清白蛋白重复此步骤，以阻止剩余的未包被表面，并在实验中以1至10， 000的最终稀释度使用珠子。要制备肌动肌肽溶液，解冻储存在零下80摄氏度的蛋白质等分试样并将其放在冰上。

然后制备溶液，达到终浓度为10毫摩尔Tris，5微摩尔G-肌动蛋白，280纳摩尔GST筋膜和1.67纳摩尔肌球蛋白II.取聚乙二醇钝化盖玻片中的一种。将涂有油脂的副成型垫片放在其顶部，然后将其放入样品架中。将1.1微升肌动肌肽溶液加入支架安装的盖玻片中，并将第二个盖玻片放在顶部。

拧紧支架以密封样品。将样品架放在显微镜上并开始采集。提前准备显微镜以减少初始采集时间。

要使用倒置荧光显微镜对样品进行成像，请使用2.5倍物镜的低放大倍率可视化整个凝胶区域，并随时间跟踪其宏观收缩。使用10倍物镜表征网络孔隙度和结构，并跟踪网络自组织和随时间的收缩。对于同时进行双色成像，以488纳米激发肌动蛋白，在561纳米激发肌球蛋白II马达，并使用双发射装置在EMCCD相机上同时记录图像。

使用相同的成像系统同时对肌动蛋白凝胶和荧光肌球蛋白II马达进行成像。对于同时双色成像，在488纳米处激发肌动蛋白，在561纳米处激发2， 300纳米磁珠。并使用双发射设备在EMCCD相机上同时记录图像。

使用相同的成像系统同时对肌动蛋白凝胶和荧光珠进行成像。第一天涉及证明肌动球蛋白网络表现为弹性材料。此处描述了肌动球蛋白网络的示意图。

荧光显微镜图像表明，肌动蛋白丝自发成核并聚合成各向同性的互连网络，该网络随时间变粗并最终在宏观上收缩。网络吸引在凝胶外围启动并向内传播到凝胶块中。凝胶中心用C标记，肌动蛋白丝束在网络收缩期间保持笔直。

此处显示了 T316 秒和 T327 秒处等高线长度与端到端距离之间的比率分布。第二个目的是证明向外的溶剂流动是由肌球蛋白收缩力产生的。此处显示了收缩中间阶段低放大倍率下的凝胶图像。

这些圆圈标记了四个珠子的位置。箭头标记珠子运动的全局方向。这里描绘了九颗选定珠子的轨迹。

这里描述了在收缩的高级阶段解析网络孔隙率和溶剂在凝胶孔中的移动。第三个目标是证明应力松弛的特征在于有效的多孔弹性扩散常数。此处显示了收缩行动球蛋白凝胶在低放大倍率下从混合时间到稳态的俯视图荧光图像。

肌动蛋白网络表现为多孔弹性活性材料。在尝试此过程时，请快速准确地工作，并牢记表面保存的重要性。