Abbiamo sviluppato un approccio in vitro per caratterizzare la meccanica dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello del citoscheletro cellulare e, più in generale, del citoplasma, che hanno dimostrato di comportarsi come un materiale attivo poroelastico. Questo metodo fornisce informazioni su come la contrattilità della miosina contribuisce all'emergere di un flusso di fluido e su come le velocità della rete e del citosol sono correlate nel tempo e nello spazio. Questo semplice approccio ci consente di estrarre le proprietà meccaniche di sistemi in evoluzione dinamica senza utilizzare attrezzature o tecniche sofisticate in cui strumenti convenzionali come AFIM non possono essere impiegati.
Questo metodo può fornire approfondimenti sulla reologia dei materiali attivi poroelastici indipendentemente dalla specificità del gel attivo e del fluido incorporato. Per iniziare, posizionare da 10 a 12 coprivetrini numero 1,5 in un supporto in politetrafluoroetilene fatto in casa e preparare la soluzione di Piranha in un becher da 400 millilitri. Preparare la soluzione sul ghiaccio in una cappa chimica.
Trasferire il supporto nel becher riempito di Piranha. Dopo tre ore, trasferire il supporto in un becher pulito riempito con acqua fresca bidistillata per lavare il Piranha in eccesso dai vetrini di copertura e trasferire il becher in un bagno di sonicazione a 80 hertz e piena potenza per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Ripetere questo passaggio altre due volte con acqua fresca bidistillata.
Per la salinizzazione, trasferire il supporto in un becher pulito riempito con 300 millilitri di metanolo puro, quindi in un bagno di sonicazione per 30 minuti. Quindi trasferire il supporto in una soluzione silana. Sigillare il becher con parafilm e tenerlo in frigorifero a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, trasferire il supporto in un becher pulito riempito con 300 millilitri di metanolo puro per 15 secondi. Asciugare il fondo del supporto per rimuovere il metanolo in eccesso e trasferirlo in un becher pulito. Quindi trasferire il becher nel forno per asciugare i coperchi di vetro per cinque minuti a 120 gradi Celsius.
Per ottenere la passivazione superficiale, prendere due vetrini per ogni esperimento e metterli in una capsula di Petri rivestita con uno strato di parafilm inizialmente pulito con etanolo. Incubare ogni coprislip con un millilitro di metossipolietilenglicole maleimmide in 1X PBS per un'ora a 22 gradi Celsius. Alla fine del processo di incubazione, inclinare la piastra di Petri per rimuovere e ancorare.
Risciacquare ogni coprislip con cinque millilitri di acqua bidistillata e asciugare con un flusso di azoto gassoso. Poiché i coprivetrini devono essere tenuti bagnati dopo la passivazione, mettere immediatamente un millilitro di Tris da 10 millimolari sulle superfici pegilate e utilizzare i coprivetrini con due ore. Per formare grandi aggregati di miosina, diluire la soluzione madre di miosina con Tris 10 millimolari per raggiungere una concentrazione finale di 25 millimolari di cloruro di potassio.
Conservare la soluzione di miosina diluita per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferirla sul ghiaccio fino all'uso. I motori sono completamente attivi per un massimo di due ore. per tracciare il flusso di solvente attraverso i pori del gel, preparare sfere fluorescenti passivate e ridurre l'interazione tra le perle e la rete di actomiosina incubando un microlitro di perle con cinque micromolari G-actina per 20 minuti.
Rimuovere l'eccesso di G-actina mediante centrifugazione. Ripetere questo passaggio con 10 milligrammi per millilitro di albumina sierica bovina per bloccare la superficie rimanente non rivestita e utilizzare le perle ad una diluizione finale da uno a 10.000 negli esperimenti. Per preparare la soluzione di actomiosina, scongelare le aliquote proteiche immagazzinate a meno 80 gradi Celsius e metterle sul ghiaccio.
Quindi preparare la soluzione per raggiungere una concentrazione finale di 10 millimolari Tris, cinque micromolari G-actina, 280 nanomolare GST Fascin e 1,67 nanomolare miosina II.Prendere uno dei vetrini di copertura passivati in polietilenglicole. Posizionare un distanziatore paraforme unto sopra di esso e posizionarlo nel supporto del campione. Aggiungere 1,1 microlitri della soluzione di actomiosina al coprislip montato sul supporto e posizionare il secondo coprislip sulla parte superiore.
Avvitare il supporto per sigillare il campione. Posizionare il supporto del campione sul microscopio e avviare l'acquisizione. Preparare il microscopio in anticipo per ridurre il tempo di acquisizione iniziale.
Per visualizzare i campioni con un microscopio fluorescente invertito, visualizzare l'intera area del gel utilizzando bassi ingrandimenti dell'obiettivo 2,5X e seguire la sua contrazione macroscopica nel tempo. Utilizzare un obiettivo 10X per caratterizzare la porosità e la struttura della rete e seguire l'auto-organizzazione e la contrazione della rete nel tempo. Per l'imaging simultaneo a due colori, eccitare l'actina a 488 nanometri e i motori della miosina II a 561 nanometri e registrare le immagini simultaneamente su una telecamera EMCCD utilizzando un apparecchio a doppia emissione.
Utilizzare lo stesso sistema di imaging per visualizzare contemporaneamente il gel di actina e i motori fluorescenti della miosina II. Per l'imaging simultaneo a due colori, eccitare l'actina a 488 nanometri e 2.300 nanometri a 561 nanometri. E registrare le immagini simultaneamente su una telecamera EMCCD utilizzando un apparecchio a doppia emissione.
Utilizzare lo stesso sistema di imaging per visualizzare contemporaneamente il gel di actina e le perle fluorescenti. Il primo giorno prevede la dimostrazione che la rete di actomiosina si comporta come un materiale elastico. Una rappresentazione schematica di una rete di actomiosina è raffigurata qui.
Le immagini al microscopio a fluorescenza dimostrano che i filamenti di actina si nucleano spontaneamente e polimerizzano in una rete isotropa interconnessa che diventa grossolana con il tempo e alla fine si contrae macroscopicamente. L'attrazione della rete inizia alla periferia del gel e si propaga verso l'interno nella massa del gel. Il centro del gel è contrassegnato con una C.I fasci di filamenti di actina rimangono dritti durante la contrazione della rete.
La distribuzione del rapporto tra la lunghezza del contorno e la distanza end-to-end a T316 secondi e T327 secondi è mostrata qui. Il secondo obiettivo consiste nel dimostrare che un flusso di solvente verso l'esterno è generato dalla contrattilità della miosina. L'immagine del gel a basso ingrandimento nelle fasi intermedie della contrazione è mostrata qui.
Questi cerchi segnano le posizioni di quattro perline. Le frecce segnano la direzione globale del movimento delle perline. Le traiettorie delle nove perle selezionate sono rappresentate qui.
Qui viene illustrata la risoluzione della porosità della rete e il movimento del solvente attraverso i pori del gel nelle fasi avanzate della contrazione. Il terzo obiettivo consiste nel dimostrare che il rilassamento da stress è caratterizzato da un'efficace costante di diffusione poroelastica. Qui sono mostrate immagini di fluorescenza di un gel di actomiosina che si contrae a basso ingrandimento dal tempo di miscelazione fino allo stato stazionario.
Le reti di actomiosina si comportano come un materiale attivo poroelastico. Mentre si tenta questa procedura, lavorare in modo rapido e preciso e tenere presente l'importanza della conservazione delle superfici.
