Poroelastik aktomiyosin jellerinin mekaniğini, hücre sitoiskeletinin ve daha genel olarak, poroelastik bir aktif materyal olarak davrandığı gösterilen sitoplazmanın model bir sistemi olarak karakterize etmek için in vitro bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntem, miyozin kontraktilitesinin bir sıvı akışının ortaya çıkmasına nasıl katkıda bulunduğuna ve ağ ve sitosol hızlarının zaman ve uzayda nasıl ilişkili olduğuna dair içgörüler sağlar. Bu basit yaklaşım, AFIM gibi geleneksel araçların kullanılamadığı herhangi bir sofistike ekipman veya teknik kullanmadan dinamik olarak gelişen sistemlerin mekanik özelliklerini çıkarmamızı sağlar.
Bu yöntem, aktif jelin ve gömülü sıvının özgüllüğünden bağımsız olarak poroelastik aktif malzemelerin reolojisi hakkında fikir verebilir. Başlamak için, ev yapımı bir politetrafloroetilen tutucuya 10 ila 12 numaralı 1.5 cam örtü fişi yerleştirin ve 400 mililitrelik bir beherde Piranha çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi kimyasal bir başlıkta buz üzerinde hazırlayın.
Tutucuyu Piranha dolgulu beher içine aktarın. Üç saat sonra, fazla Piranha'yı kapaklardan yıkamak için tutucuyu taze çift damıtılmış suyla doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın ve beheri 80 hertz'de bir sonikasyon banyosuna ve 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca tam güce aktarın. Bu adımı taze çift damıtılmış su ile iki kez daha tekrarlayın.
Tuzlanma için, tutucuyu 300 mililitre saf metanol ile doldurulmuş temiz bir behere, ardından 30 dakika boyunca bir sonikasyon banyosuna aktarın. Daha sonra tutucuyu bir silan çözeltisine aktarın. Beheri parafilmle kapatın ve gece boyunca buzdolabında dört santigrat derecede saklayın.
Ertesi gün, tutucuyu 15 saniye boyunca 300 mililitre saf metanol ile doldurulmuş temiz bir beher içine aktarın. Fazla metanolü çıkarmak için tutucunun tabanını kurutun ve temiz bir behere aktarın. Ardından, cam kapakları 120 santigrat derecede beş dakika kurutmak için beheri fırına aktarın.
Yüzey pasivasyonunu elde etmek için, her deney için iki kapak parçası alın ve bunları başlangıçta etanol ile temizlenmiş bir parafilm tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin. Her bir kapak kaymasını, 22 santigrat derecede bir saat boyunca 1X PBS'de bir mililitre metoksipolietilen glikol maleimid ile inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, Petri kabını çıkarmak ve sabitlemek için eğin.
Her bir kapağı beş mililitre çift damıtılmış suyla durulayın ve azot gazı akışıyla kurutun. Pasivasyondan sonra kapakların ıslak tutulması gerektiğinden, pegile yüzeylere hemen bir mililitre 10 milimolar Tris koyun ve kapak fişlerini iki saat boyunca kullanın. Büyük miyozin agregaları oluşturmak için, nihai 25 milimolar potasyum klorür konsantrasyonuna ulaşmak için miyozin stok çözeltisini 10 milimolar Tris ile seyreltin.
Seyreltilmiş miyozin çözeltisini oda sıcaklığında 10 dakika bekletin ve kullanana kadar buza aktarın. Motorlar iki saate kadar tamamen aktiftir. jel gözenekleri boyunca çözücü akışını izlemek için, pasifleştirilmiş floresan boncuklar hazırlayın ve bir mikrolitre boncuğu beş mikromolar G-aktin ile 20 dakika boyunca inkübe ederek boncuklar ile aktomiyosin ağı arasındaki etkileşimi azaltın.
Fazla G-aktinini santrifüjleme ile çıkarın. Kalan kaplanmamış yüzeyi bloke etmek için mililitre sığır serum albümini başına 10 miligram ile bu adımı tekrarlayın ve boncukları deneylerde bir ila 10.000 arasında son seyreltmede kullanın. Aktomiyosin çözeltisini hazırlamak için, eksi 80 santigrat derecede depolanan protein alikotlarını çözün ve buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra çözeltiyi 10 milimolar Tris, beş mikromolar G-aktin, 280 nanomolar GST Fascin ve 1.67 nanomolar miyozin II.Polietilen glikol pasifleştirilmiş kapak kaymalarından birini nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde hazırlayın. Üzerine yağlanmış bir paraform ara parça yerleştirin ve numune tutucuya yerleştirin. Tutucuya monte edilmiş kapak kaymasına 1,1 mikrolitre aktomiyosin çözeltisi ekleyin ve ikinci kapak kapağını üstüne yerleştirin.
Numuneyi kapatmak için tutucuyu vidalayın. Numune tutucuyu mikroskop üzerine yerleştirin ve edinimi başlatın. İlk edinme süresini azaltmak için mikroskobu önceden hazırlayın.
Örnekleri ters çevrilmiş bir floresan mikroskopla görüntülemek için, 2.5X hedefinin düşük büyütmelerini kullanarak tüm jel alanını görselleştirin ve zamanla makroskopik büzülmesini izleyin. Ağ gözenekliliğini ve yapısını karakterize etmek ve ağın kendi kendine örgütlenmesini ve zamanla daralmasını takip etmek için 10X'lik bir hedef kullanın. Eşzamanlı iki renkli görüntüleme için, 488 nanometrede aktini ve 561 nanometrede miyozin II motorlarını heyecanlandırın ve görüntüleri aynı anda bir çift emisyon aparatı kullanarak bir EMCCD kameraya kaydedin.
Aktin jelini ve floresan miyozin II motorlarını aynı anda görüntülemek için aynı görüntüleme sistemini kullanın. Aynı anda iki renkli görüntüleme için, aktini 488 nanometrede ve 2.300 nanometre boncukları 561 nanometrede heyecanlandırın. Ve çift emisyon aparatı kullanarak görüntüleri aynı anda bir EMCCD kameraya kaydedin.
Aktin jelini ve floresan boncukları aynı anda görüntülemek için aynı görüntüleme sistemini kullanın. İlk gün, aktomiyosin ağının elastik bir malzeme gibi davrandığını göstermeyi içerir. Burada bir aktomiyosin ağının şematik bir temsili tasvir edilmiştir.
Floresan mikroskopi görüntüleri, aktin filamentlerinin kendiliğinden çekirdeklendiğini ve zamanla kabalaşan ve sonunda makroskopik olarak büzülen izotropik birbirine bağlı bir ağa polimerize olduğunu göstermektedir. Ağ çekimi jel çevresinde başlar ve jel kütlesine doğru içeri doğru yayılır. Jel merkezi bir C ile işaretlenmiştir.Aktin filament demetleri ağ daralması sırasında düz kalır.
Kontur uzunluğu ile uçtan uca mesafe arasındaki oranın T316 saniye ve T327 saniyedeki dağılımı burada gösterilmiştir. İkinci amaç, dışa doğru bir çözücü akışının miyozin kontraktilitesi tarafından üretildiğini göstermeyi içerir. Kasılmanın ara aşamalarında jelin düşük büyütmedeki görüntüsü burada gösterilmiştir.
Bu daireler dört boncuğun konumlarını işaretler. Oklar, boncuk hareketinin küresel yönünü işaretler. Seçilen dokuz boncuğun yörüngeleri burada tasvir edilmiştir.
Ağ gözenekliliğinin çözülmesi ve çözücünün kasılmanın ileri aşamalarında jel gözenekleri boyunca hareketi burada tasvir edilmiştir. Üçüncü amaç, stres gevşemesinin etkili bir poroelastik difüzyon sabiti ile karakterize olduğunu göstermeyi içerir. Karıştırma süresinden kararlı duruma kadar düşük büyütmede büzülen bir aktomiyosin jelinin üstten görünümlü floresan görüntüleri burada gösterilmiştir.
Aktomiyosin ağları poroelastik aktif bir madde gibi davranır. Bu prosedürü denerken, hızlı ve doğru çalışın ve yüzey korumasının önemini unutmayın.
