Nous avons développé une approche in vitro pour caractériser la mécanique des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire, et plus généralement, du cytoplasme, dont il a été démontré qu’ils se comportent comme un matériau actif poroélastique. Cette méthode permet de mieux comprendre comment la contractilité de la myosine contribue à l’émergence d’un écoulement de fluide et comment les vitesses du réseau et du cytosol sont corrélées dans le temps et l’espace. Cette approche simple nous permet d’extraire les propriétés mécaniques de systèmes évolutifs dynamiquement sans utiliser d’équipement ou de techniques sophistiquées où des outils conventionnels comme AFIM ne peuvent pas être utilisés.
Cette méthode peut fournir des informations sur la rhéologie des matériaux actifs poroélastiques, quelle que soit la spécificité du gel actif et du fluide incorporé. Pour commencer, placez 10 à 12 lamelles de verre numéro 1.5 dans un support en polytétrafluoroéthylène fait maison et préparez la solution de Piranha dans un bécher de 400 millilitres. Préparer la solution sur de la glace dans une hotte chimique.
Transférer le support dans le bécher rempli de piranha. Après trois heures, transférer le support dans un bécher propre rempli d’eau distillée double fraîche pour laver l’excès de Piranha des lamelles de couverture et transférer le bécher dans un bain de sonication à 80 hertz et à pleine puissance pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Répétez cette étape deux fois de plus avec de l’eau fraîche bidistillée.
Pour la salinisation, transférer le support dans un bécher propre rempli de 300 millilitres de méthanol pur, puis dans un bain de sonication pendant 30 minutes. Transférer ensuite le support dans une solution de silane. Scellez le bécher avec du parafilm et conservez-le au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, transférez le support dans un bécher propre rempli de 300 millilitres de méthanol pur pendant 15 secondes. Sécher le fond du support pour enlever l’excès de méthanol et le transférer dans un bécher propre. Ensuite, transférez le bécher au four pour sécher les lamelles de verre pendant cinq minutes à 120 degrés Celsius.
Pour obtenir une passivation de surface, prenez deux lamelles de couverture pour chaque expérience et placez-les dans une boîte de Petri recouverte d’une couche de parafilm initialement nettoyée à l’éthanol. Incuber chaque lamelle de couverture avec un millilitre de maléimide de méthoxypolyéthylèneglycol dans 1X PBS pendant une heure à 22 degrés Celsius. À la fin du processus d’incubation, inclinez la boîte de Petri pour la retirer et l’attacher.
Rincer chaque couvercle avec cinq millilitres d’eau bidistillée et sécher avec un flux d’azote gazeux. Étant donné que les lamelles de couverture doivent être maintenues humides après la passivation, mettez immédiatement un millilitre de Tris 10 millimolaires sur les surfaces pégylées et utilisez les lamelles de couverture pendant deux heures. Pour former de gros agrégats de myosine, diluer la solution mère de myosine avec 10 millimolaires de Tris pour atteindre une concentration finale de 25 millimolaires de chlorure de potassium.
Conservez la solution de myosine diluée pendant 10 minutes à température ambiante, puis transférez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. Les moteurs sont pleinement actifs jusqu’à deux heures. pour suivre l’écoulement du solvant à travers les pores du gel, préparer des billes fluorescentes passivées et réduire l’interaction entre les billes et le réseau d’actomyosine en incubant un microlitre de billes avec cinq G-actine micromolaire pendant 20 minutes.
Éliminer l’excès de G-actine par centrifugation. Répétez cette étape avec 10 milligrammes par millilitre d’albumine sérique bovine pour bloquer la surface non enduite restante et utilisez les billes à une dilution finale de un à 10 000 dans les expériences. Pour préparer la solution d’actomyosine, décongelez les aliquotes protéiques stockées à moins 80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace.
Ensuite, préparez la solution pour atteindre une concentration finale de 10 millimolaires Tris, cinq micromolaires G-actine, 280 nanomolaires GST Fascin, et 1,67 nanomolaire myosine II.Prenez l’un des couvercles passivés en polyéthylèneglycol. Placez une entretoise paraforme graissée sur le dessus et placez-la dans le porte-échantillon. Ajouter 1,1 microlitre de la solution d’actomyosine au couvercle monté sur support et placer le deuxième couvercle sur le dessus.
Vissez le support pour sceller l’échantillon. Placez le porte-échantillon sur le microscope et commencez l’acquisition. Préparez le microscope à l’avance pour réduire le temps d’acquisition initial.
Pour imager les échantillons avec un microscope fluorescent inversé, visualisez toute la zone de gel en utilisant de faibles grossissements de 2,5X objectif et suivez sa contraction macroscopique avec le temps. Utilisez un objectif 10X pour caractériser la porosité et la structure du réseau et pour suivre l’auto-organisation et la contraction du réseau avec le temps. Pour l’imagerie bicolore simultanée, excitez l’actine à 488 nanomètres et les moteurs de myosine II à 561 nanomètres et enregistrez les images simultanément sur une caméra EMCCD à l’aide d’un appareil à double émission.
Utilisez le même système d’imagerie pour imager simultanément le gel d’actine et les moteurs fluorescents de myosine II. Pour une imagerie bicolore simultanée, excitez l’actine à 488 nanomètres et 2 perles de 300 nanomètres à 561 nanomètres. Et enregistrez les images simultanément sur une caméra EMCCD à l’aide d’un appareil à double émission.
Utilisez le même système d’imagerie pour imager simultanément le gel d’actine et les billes fluorescentes. Le premier jour consiste à démontrer que le réseau d’actomyosine se comporte comme un matériau élastique. Une représentation schématique d’un réseau d’actomyosine est représentée ici.
Les images de microscopie à fluorescence démontrent que les filaments d’actine nucléent spontanément et polymérisent en un réseau isotrope interconnecté qui grossit avec le temps et finit par se contracter macroscopiquement. L’attraction du réseau commence à la périphérie du gel et se propage vers l’intérieur dans la masse de gel. Le centre du gel est marqué d’un C.Les faisceaux de filaments d’actine restent droits pendant la contraction du réseau.
La distribution du rapport entre la longueur du contour et la distance de bout en bout à T316 secondes et T327 secondes est illustrée ici. Le deuxième objectif consiste à démontrer qu’un flux de solvant sortant est généré par la contractilité de la myosine. L’image du gel à faible grossissement aux stades intermédiaires de contraction est montrée ici.
Ces cercles marquent les positions de quatre perles. Les flèches marquent la direction globale du mouvement de la perle. Les trajectoires des neuf perles sélectionnées sont représentées ici.
La résolution de la porosité du réseau et le mouvement du solvant à travers les pores du gel à des stades avancés de contraction sont décrits ici. Le troisième objectif consiste à démontrer que la relaxation des contraintes est caractérisée par une constante de diffusion poroélastique efficace. Les images de fluorescence d’un gel d’actomyosine contractant à faible grossissement du temps de mélange jusqu’à l’état d’équilibre sont montrées ici.
Les réseaux d’actomyosine se comportent comme un matériau actif poroélastique. Lorsque vous tentez cette procédure, travaillez rapidement et avec précision et gardez à l’esprit l’importance de la préservation de la surface.
