Мы разработали подход in vitro для характеристики механики пороупругих гелей актомиозина как модельной системы клеточного цитоскелета и, в более общем плане, цитоплазмы, которые, как было показано, ведут себя как пороупругий активный материал. Этот метод дает представление о том, как сократимость миозина способствует возникновению потока жидкости и как скорости сети и цитозоля коррелируют во времени и пространстве. Этот простой подход позволяет нам извлекать механические свойства динамически развивающихся систем без использования какого-либо сложного оборудования или методов, где обычные инструменты, такие как AFIM, не могут быть использованы.
Этот метод может дать представление о реологии пороупругих активных материалов независимо от специфики активного геля и встроенной жидкости. Для начала поместите от 10 до 12 стеклянных покровных стекол No 1,5 в самодельный держатель из политетрафторэтилена и приготовьте раствор Piranha в стакане объемом 400 миллилитров. Приготовьте раствор на льду в химическом колпаке.
Переложите держатель в стакан, наполненный пираньей. Через три часа переложите держатель в чистый стакан, наполненный свежей двойной дистиллированной водой, чтобы смыть излишки пираньи с покровных стекол, и перенесите стакан в ванну для обработки ультразвуком при частоте 80 герц и на полной мощности в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. Повторите этот шаг еще два раза со свежей двойной дистиллированной водой.
Для засоления переложите держатель в чистый стакан, наполненный 300 миллилитрами чистого метанола, а затем в ванну для обработки ультразвуком на 30 минут. Затем переведите держатель в силановый раствор. Запечатайте стакан парапленкой и храните его в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.
На следующий день переложите держатель в чистый стакан, наполненный 300 миллилитрами чистого метанола на 15 секунд. Высушите нижнюю часть держателя, чтобы удалить излишки метанола, и перелейте его в чистый стакан. Затем переложите стакан в духовку, чтобы высушить стекло в течение пяти минут при температуре 120 градусов Цельсия.
Чтобы добиться пассивации поверхности, возьмите два покровных стекла для каждого эксперимента и поместите их в чашку Петри, покрытую слоем парапленки, первоначально очищенным этанолом. Инкубируйте каждое покровное стекло с одним миллилитром метоксиполиэтиленгликоля малеимида в 1X PBS в течение одного часа при температуре 22 градуса Цельсия. В конце процесса инкубации наклоните чашку Петри, чтобы вынуть и приколоть.
Промойте каждое покровное стекло пятью миллилитрами двойной дистиллированной воды и высушите потоком газообразного азота. Поскольку покровные стекла должны оставаться влажными после пассивации, немедленно нанесите один миллилитр 10-миллимолярного триса на пегилированные поверхности и используйте покровные стекла в течение двух часов. Чтобы сформировать большие агрегаты миозина, разбавьте исходный раствор миозина 10 миллимолярным Tris, чтобы достичь конечной концентрации 25 миллимоляров хлорида калия.
Держите разбавленный раствор миозина в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем переложите его на лед до использования. Двигатели полностью активны до двух часов. чтобы отслеживать поток растворителя через поры геля, приготовьте пассивированные флуоресцентные шарики и уменьшите взаимодействие между шариками и актомиозиновой сетью, инкубируя один микролитр шариков с пятью микромолярными G-актином в течение 20 минут.
Удалите избыток G-актина центрифугированием. Повторите этот шаг с 10 миллиграммами на миллилитр бычьего сывороточного альбумина, чтобы заблокировать оставшуюся поверхность без покрытия, и используйте шарики в окончательном разведении от одного до 10 000 в экспериментах. Чтобы приготовить раствор актомиозина, разморозьте белковые аликвоты, хранящиеся при температуре минус 80 градусов по Цельсию, и поместите их на лед.
Затем приготовьте раствор до достижения конечной концентрации 10 миллимолярных трис, пяти микромолярных G-актина, 280 наномолярных GST фасцина и 1,67 наномолярного миозина II. Поместите поверх него смазанную маслом прокладку из параформы и поместите ее в держатель образца. Добавьте 1,1 микролитра раствора актомиозина в прилагаемое к держателю покровное стекло и поместите второе покровное стекло сверху.
Закрутите держатель, чтобы запечатать образец. Поместите держатель образца на микроскоп и начните сбор. Подготовьте микроскоп заранее, чтобы сократить время первоначального сбора.
Чтобы получить изображение образцов с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, визуализируйте всю область геля, используя низкое увеличение объектива в 2,5 раза, и проследите его макроскопическое сжатие со временем. Используйте цель 10X, чтобы охарактеризовать пористость и структуру сети, а также проследить самоорганизацию и сжатие сети со временем. Для одновременной двухцветной визуализации возбуждайте актин на 488 нанометрах и моторы миозина II на 561 нанометре и одновременно записывайте изображения на камеру EMCCD с помощью устройства с двойным излучением.
Используйте одну и ту же систему визуализации для одновременного изображения актинового геля и флуоресцентных моторов миозина II. Для одновременной двухцветной визуализации возбуждайте актин на 488 нанометрах и 2 300 нанометровых шариков на 561 нанометре. И одновременно записывайте изображения на камеру EMCCD с помощью устройства с двойным излучением.
Используйте одну и ту же систему визуализации для одновременного изображения актинового геля и флуоресцентных шариков. Первый день включает в себя демонстрацию того, что сеть актомиозина ведет себя как эластичный материал. Схематическое изображение сети актомиозина.
Изображения флуоресцентной микроскопии показывают, что актиновые нити самопроизвольно зарождаются и полимеризуются в изотропную взаимосвязанную сеть, которая со временем грубеет и в конечном итоге макроскопически сжимается. Сетевое притяжение начинается на периферии геля и распространяется внутрь в гелевую массу. Центр геля отмечен буквой C. Пучки актиновых филаментов остаются прямыми во время сокращения сети.
Здесь показано распределение соотношения между длиной контура и сквозным расстоянием при Т316 секунд и Т327 секундах. Вторая цель включает в себя демонстрацию того, что поток растворителя наружу генерируется сократимостью миозина. Показано изображение геля при малом увеличении на промежуточных стадиях сокращения.
Эти круги отмечают положение четырех бусин. Стрелки отмечают глобальное направление движения бусины. Здесь изображены траектории движения девяти выбранных бусин.
Здесь показано разрешение пористости сетки и движение растворителя по порам геля на поздних стадиях сжатия. Третья цель состоит в том, чтобы продемонстрировать, что релаксация напряжений характеризуется эффективной постоянной пороупругой диффузии. Здесь показаны флуоресцентные изображения сжимающегося геля актомиозина сверху при малом увеличении от времени смешивания до стационарного состояния.
Сети актомиозина ведут себя как пороупругий активный материал. Пытаясь выполнить эту процедуру, работайте быстро и точно и помните о важности сохранения поверхности.
