우리는 세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위한 시험관 내 접근법을 개발했으며, 보다 일반적으로 다공탄성 활성 물질로 거동하는 것으로 밝혀진 세포질. 이 방법은 미오신 수축성이 유체 흐름의 출현에 어떻게 기여하는지, 그리고 네트워크와 세포질 속도가 시간과 공간에서 어떻게 상관되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 간단한 접근 방식을 통해 AFIM과 같은 기존 도구를 사용할 수 없는 정교한 장비나 기술을 사용하지 않고도 동적으로 진화하는 시스템의 기계적 특성을 추출할 수 있습니다.
이 방법은 활성 겔과 포매된 유체의 특이성에 관계없이 다공성 활성 물질의 유변학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 수제 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 홀더에 10-12 개의 1.5 번 유리 커버 슬립을 넣고 400 밀리리터 비커에 피라냐 용액을 준비하십시오. 화학 후드의 얼음 위에 용액을 준비하십시오.
홀더를 피라냐가 채워진 비커에 옮깁니다. 3 시간 후, 홀더를 신선한 이중 증류수로 채워진 깨끗한 비커로 옮겨 커버 슬립에서 과도한 피라냐를 씻어 내고 비커를 80 헤르츠의 초음파 처리 욕조로 옮기고 섭씨 25도에서 10 분 동안 최대 전력으로 옮깁니다. 신선한 이중 증류수로 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
염분화를 위해 홀더를 300 밀리리터의 순수한 메탄올로 채워진 깨끗한 비커로 옮긴 다음 30 분 동안 초음파 처리 욕조에 넣습니다. 그런 다음 홀더를 실란 용액으로 옮깁니다. 비커를 파라필름으로 밀봉하고 섭씨 4도의 냉장고에 밤새 보관합니다.
다음날 홀더를 300ml의 순수 메탄올로 채워진 깨끗한 비커에 15초 동안 옮깁니다. 홀더 바닥을 건조시켜 과도한 메탄올을 제거하고 깨끗한 비커에 옮깁니다. 그런 다음 비커를 오븐으로 옮겨 섭씨 120도에서 5분 동안 유리 커버슬립을 건조시킵니다.
표면 패시베이션을 달성하려면 각 실험에 대해 두 개의 커버 슬립을 가져 와서 처음에 에탄올로 세척 한 파라 필름 층으로 코팅 된 페트리 접시에 넣습니다. 섭씨 22도에서 1시간 동안 1X PBS에 1밀리리터의 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드와 함께 각 커버슬립을 배양합니다. 배양 과정이 끝나면 페트리 접시를 기울여 제거하고 못을 박습니다.
각 커버 슬립을 5 밀리리터의 이중 증류수로 헹구고 질소 가스의 흐름으로 건조시킵니다. 커버 슬립은 패시베이션 후 젖은 상태로 유지해야하므로 즉시 10 밀리 몰의 트리스 1 밀리리터를 페 길화 된 표면에 놓고 커버 슬립을 2 시간 동안 사용하십시오. 큰 미오신 응집체를 형성하려면 미오신 원액을 10 밀리몰 트리스로 희석하여 25 밀리몰 염화칼륨의 최종 농도에 도달합니다.
희석 된 미오신 용액을 실온에서 10 분 동안 보관 한 다음 사용할 때까지 얼음으로 옮깁니다. 모터는 최대 2시간 동안 완전히 작동합니다. 겔 공극을 가로지르는 용매 흐름을 추적하기 위해 부동태화된 형광 비드를 준비하고 1마이크로리터의 비드를 5마이크로몰 G-액틴과 20분 동안 배양하여 비드와 악토미오신 네트워크 사이의 상호 작용을 줄입니다.
원심분리에 의해 과량의 G-액틴을 제거한다. 소 혈청 알부민 밀리리터당 10 밀리그램으로 이 단계를 반복하여 코팅되지 않은 나머지 표면을 차단하고 실험에서 1 내지 10, 000의 최종 희석액으로 비드를 사용한다. 악토미오신 용액을 준비하기 위해, 섭씨 영하 80도에서 저장된 단백질 분취액을 해동하고 얼음 위에 놓는다.
그런 다음 10 밀리몰 트리스, 5 마이크로 몰 G- 액틴, 280 나노 몰 GST 파시안 및 1.67 나노 몰 미오신 II.의 최종 농도에 도달하도록 용액을 준비합니다. 그 위에 기름칠한 파라폼 스페이서를 놓고 샘플 홀더에 넣습니다. 1.1마이크로리터의 액토미오신 용액을 홀더에 장착된 커버슬립에 추가하고 두 번째 커버슬립을 맨 위에 놓습니다.
홀더를 조여 샘플을 밀봉합니다. 샘플 홀더를 현미경에 놓고 수집을 시작합니다. 초기 획득 시간을 줄이기 위해 현미경을 미리 준비하십시오.
도립 형광 현미경으로 시료를 이미지화하려면 2.5X 대물렌즈의 낮은 배율을 사용하여 전체 겔 영역을 시각화하고 시간에 따른 거시적 수축을 추적합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 네트워크 다공성 및 구조를 특성화하고 시간에 따른 네트워크 자체 구성 및 수축을 추적합니다. 동시 2색 이미징의 경우 488나노미터에서 액틴을 여기시키고 561나노미터에서 미오신 II 모터를 여기시키고 이중 방출 장치를 사용하여 EMCCD 카메라에 이미지를 동시에 기록합니다.
동일한 이미징 시스템을 사용하여 액틴 겔과 형광 미오신 II 모터를 동시에 이미징할 수 있습니다. 동시 2 색 이미징의 경우 488 나노 미터에서 액틴을, 561 나노 미터에서 2, 300 나노 미터 비드를 여기시킵니다. 그리고 이중 방출 장치를 사용하여 EMCCD 카메라에 이미지를 동시에 기록할 수 있습니다.
동일한 이미징 시스템을 사용하여 액틴 겔과 형광 비드를 동시에 이미징합니다. 첫날은 악토미오신 네트워크가 탄성 물질로 작용한다는 것을 입증하는 것입니다. 악토미오신 네트워크의 개략도가 여기에 묘사되어 있습니다.
형광 현미경 이미지는 액틴 필라멘트가 자발적으로 핵을 형성하고 등방성 상호 연결된 네트워크로 중합되어 시간이 지남에 따라 거칠어지고 결국 거시적으로 수축한다는 것을 보여줍니다. 네트워크 인력은 겔 주변에서 시작하여 겔 벌크 내부로 전파됩니다. 젤 중심은 C.Actin 필라멘트 다발로 네트워크 수축 도중 똑바른 남아 있습니다로 표시됩니다.
T316초와 T327초에서 등고선 길이와 종단 간 거리 간의 비율 분포가 여기에 표시됩니다. 두 번째 목표는 미오신 수축성에 의해 외부 용매 흐름이 생성된다는 것을 입증하는 것입니다. 수축의 중간 단계에서 낮은 배율의 겔 이미지가 여기에 표시됩니다.
이 원은 4개의 구슬 위치를 표시합니다. 화살표는 비드 동작의 전역 방향을 표시합니다. 선택된 9 개의 구슬의 궤적이 여기에 묘사되어 있습니다.
네트워크 다공성을 해결하고 수축의 진행 단계에서 겔 기공을 가로지르는 용매의 이동이 여기에 묘사되어 있습니다. 세 번째 목표는 응력 완화가 효과적인 다공탄성 확산 상수를 특징으로 한다는 것을 입증하는 것입니다. 혼합 시간부터 정상 상태까지 낮은 배율에서 수축하는 악토미오신 겔의 평면도 형광 이미지가 여기에 표시됩니다.
악토미오신 네트워크는 다공탄성 활성 물질로 거동합니다. 이 절차를 시도하는 동안 빠르고 정확하게 작업하고 표면 보존의 중요성을 명심하십시오.
