Hemos desarrollado un enfoque in vitro para caracterizar la mecánica de los geles poroelásticos de actomiosina como un sistema modelo del citoesqueleto celular y, más generalmente, del citoplasma, que se ha demostrado que se comporta como un material activo poroelástico. Este método proporciona información sobre cómo la contractilidad de la miosina contribuye a la aparición de un flujo de fluido y cómo las velocidades de la red y el citosol se correlacionan en el tiempo y el espacio. Este enfoque simple nos permite extraer las propiedades mecánicas de los sistemas que evolucionan dinámicamente sin utilizar ningún equipo o técnica sofisticada donde no se puedan emplear herramientas convencionales como AFIM.
Este método puede proporcionar información sobre la reología de los materiales activos poroelásticos independientemente de la especificidad del gel activo y el fluido incrustado. Para comenzar, coloque de 10 a 12 cubreobjetos de vidrio número 1.5 en un soporte casero de politetrafluoroetileno y prepare la solución de piraña en un vaso de precipitados de 400 mililitros. Prepare la solución en hielo en una campana química.
Transfiera el soporte al vaso de precipitados relleno de Piraña. Después de tres horas, transfiera el soporte a un vaso de precipitados limpio lleno de agua fresca doble destilada para lavar el exceso de piraña de los cubreobjetos y transfiera el vaso de precipitados a un baño de sonicación a 80 hercios y a plena potencia durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Repita este paso dos veces más con agua fresca de doble destilación.
Para la salinización, transfiera el soporte a un vaso de precipitados limpio lleno de 300 mililitros de metanol puro, luego a un baño de sonicación durante 30 minutos. Luego transfiera el soporte a una solución de silano. Selle el vaso de precipitados con parafilm y manténgalo en el refrigerador a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, transfiera el soporte a un vaso de precipitados limpio lleno de 300 mililitros de metanol puro durante 15 segundos. Seque la parte inferior del soporte para eliminar el exceso de metanol y transfiéralo a un vaso de precipitados limpio. Luego transfiera el vaso de precipitados al horno para secar los cubreobjetos de vidrio durante cinco minutos a 120 grados centígrados.
Para lograr la pasivación superficial, tome dos cubreobjetos para cada experimento y colóquelos en una placa de Petri recubierta con una capa de parapelícula inicialmente limpiada con etanol. Incubar cada cubreobjetos con un mililitro de maleimida de metoxipolietilenglicol en 1X PBS durante una hora a 22 grados centígrados. Al final del proceso de incubación, incline la placa de Petri para retirar y fijar.
Enjuague cada cubreobjetos con cinco mililitros de agua destilada doble y séquelo con un flujo de gas nitrógeno. Dado que los cubreobjetos deben mantenerse húmedos después de la pasivación, ponga inmediatamente un mililitro de Tris 10 milimolares en las superficies pegiladas y use los cubreobjetos con dos horas. Para formar grandes agregados de miosina, diluir la solución madre de miosina con 10 Tris milimolares para alcanzar una concentración final de cloruro de potasio milimolar.
Mantenga la solución de miosina diluida durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego transfiérala al hielo hasta que la use. Los motores están completamente activos durante un máximo de dos horas. Para rastrear el flujo de solvente a través de los poros del gel, prepare perlas fluorescentes pasivadas y reduzca la interacción entre las perlas y la red de actomiosina incubando un microlitro de perlas con cinco micromolares de G-actina durante 20 minutos.
Eliminar el exceso de G-actina por centrifugación. Repita este paso con 10 miligramos por mililitro de albúmina de suero bovino para bloquear la superficie restante no recubierta y use las perlas en una dilución final de uno a 10, 000 en los experimentos. Para preparar la solución de actomiosina, descongele las alícuotas de proteínas almacenadas a menos 80 grados centígrados y colóquelas en hielo.
Luego prepare la solución para alcanzar una concentración final de 10 Tris milimolares, cinco G-actina micromolar, 280 nanomolares GST Fascin y 1.67 miosina nanomolar II. Coloque un espaciador de paraformas engrasado encima de él y colóquelo en el portamuestras. Agregue 1,1 microlitros de la solución de actomiosina al cubreobjetos montado en el soporte y coloque el segundo cubreobjetos en la parte superior.
Atornille el soporte para sellar la muestra. Coloque el portamuestras en el microscopio y comience la adquisición. Prepare el microscopio con anticipación para reducir el tiempo de adquisición inicial.
Para obtener imágenes de las muestras con un microscopio fluorescente invertido, visualice toda el área del gel utilizando aumentos bajos de 2.5X objetivo y siga su contracción macroscópica con el tiempo. Utilice un objetivo 10X para caracterizar la porosidad y estructura de la red y para seguir la autoorganización y contracción de la red con el tiempo. Para las imágenes simultáneas de dos colores, excite la actina a 488 nanómetros y los motores de miosina II a 561 nanómetros y grabe las imágenes simultáneamente en una cámara EMCCD utilizando un aparato de emisión dual.
Utilice el mismo sistema de imágenes para obtener imágenes simultáneas del gel de actina y de los motores fluorescentes de miosina II. Para obtener imágenes simultáneas de dos colores, excite la actina a 488 nanómetros y 2.300 nanómetros a 561 nanómetros. Y grabe las imágenes simultáneamente en una cámara EMCCD utilizando un aparato de doble emisión.
Utilice el mismo sistema de imágenes para obtener imágenes simultáneas del gel de actina y las perlas fluorescentes. El primer día consiste en demostrar que la red de actomiosina se comporta como un material elástico. Aquí se representa una representación esquemática de una red de actomiosina.
Las imágenes de microscopía de fluorescencia demuestran que los filamentos de actina se nuclean espontáneamente y polimerizan en una red isotrópica interconectada que se engrosa con el tiempo y finalmente se contrae macroscópicamente. La atracción de la red se inicia en la periferia del gel y se propaga hacia adentro en el volumen de gel. El centro del gel está marcado con una C.Los haces de filamentos de actina permanecen rectos durante la contracción de la red.
Aquí se muestra la distribución de la relación entre la longitud del contorno y la distancia de extremo a extremo en T316 segundos y T327 segundos. El segundo objetivo consiste en demostrar que un flujo de disolvente hacia el exterior es generado por la contractilidad de la miosina. Aquí se muestra la imagen del gel a bajo aumento en las etapas intermedias de contracción.
Estos círculos marcan las posiciones de cuatro cuentas. Las flechas marcan la dirección global del movimiento de la cuenta. Las trayectorias de las nueve cuentas seleccionadas se representan aquí.
Aquí se representa la resolución de la porosidad de la red y el movimiento del disolvente a través de los poros del gel en etapas avanzadas de contracción. El tercer objetivo consiste en demostrar que la relajación del estrés se caracteriza por una constante de difusión poroelástica efectiva. Aquí se muestran imágenes de fluorescencia de vista superior de un gel de actomiosina que se contrae a bajo aumento desde el tiempo de mezcla hasta el estado estacionario.
Las redes de actomiosina se comportan como un material activo poroelástico. Al intentar este procedimiento, trabaje de forma rápida y precisa y tenga en cuenta la importancia de la preservación de la superficie.
