Wir haben einen in vitro Ansatz entwickelt, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zytoplasmas zu charakterisieren, von denen gezeigt wurde, dass sie sich als poroelastisches aktives Material verhalten. Diese Methode gibt Aufschluss darüber, wie die Kontraktilität von Myosin zur Entstehung eines Flüssigkeitsflusses beiträgt und wie Netzwerk- und Zytosolgeschwindigkeiten zeitlich und räumlich korrelieren. Dieser einfache Ansatz ermöglicht es uns, die mechanischen Eigenschaften von sich dynamisch entwickelnden Systemen zu extrahieren, ohne ausgeklügelte Geräte oder Techniken zu verwenden, bei denen herkömmliche Werkzeuge wie AFIM nicht eingesetzt werden können.
Diese Methode kann Einblicke in die Rheologie poroelastischer Aktivmaterialien liefern, unabhängig von der Spezifität des aktiven Gels und der eingebetteten Flüssigkeit. Legen Sie zunächst 10 bis 12 Glasdeckgläser der Nummer 1,5 in einen selbstgemachten Polytetrafluorethylenhalter und bereiten Sie die Piranha-Lösung in einem 400-Milliliter-Becherglas vor. Bereiten Sie die Lösung auf Eis in einer chemischen Haube vor.
Den Halter in den Piranha-gefüllten Becher füllen. Nach drei Stunden füllen Sie den Halter in ein sauberes, mit frischem, doppelt destilliertem Wasser gefülltes Becherglas, um den überschüssigen Piranha von den Deckgläsern zu waschen, und überführen Sie den Becher in ein Beschallungsbad bei 80 Hertz und voller Leistung für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal mit frischem, doppelt destilliertem Wasser.
Zur Versalzung wird der Halter in ein sauberes, mit 300 Millilitern reinem Methanol gefülltes Becherglas und dann für 30 Minuten in ein Beschallungsbad gegeben. Übertragen Sie dann den Halter in eine Silanlösung. Verschließen Sie das Becherglas mit Parafilm und bewahren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius im Kühlschrank auf.
Am nächsten Tag den Halter für 15 Sekunden in ein sauberes Becherglas füllen, das mit 300 Millilitern reinem Methanol gefüllt ist. Trocknen Sie den Boden des Halters, um das überschüssige Methanol zu entfernen, und füllen Sie es in ein sauberes Becherglas. Anschließend das Becherglas in den Ofen schieben, um die Glasdeckgläser fünf Minuten lang bei 120 Grad Celsius zu trocknen.
Um eine Oberflächenpassivierung zu erreichen, nehmen Sie für jedes Experiment zwei Deckgläser und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit einer zunächst mit Ethanol gereinigten Parafilmschicht beschichtet ist. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit einem Milliliter Methoxyethylenglykolmaleimid in 1X PBS für eine Stunde bei 22 Grad Celsius. Kippen Sie am Ende des Inkubationsvorgangs die Petrischale, um sie zu entfernen und zu befestigen.
Spülen Sie jedes Deckglas mit fünf Millilitern doppelt destilliertem Wasser aus und trocknen Sie es mit Stickstoffgas. Da die Deckgläser nach der Passivierung feucht gehalten werden müssen, geben Sie sofort einen Milliliter 10 Millimolar Tris auf die pegylierten Oberflächen und verwenden Sie die Deckgläser innerhalb von zwei Stunden. Um große Myosin-Aggregate zu bilden, wird die Myosin-Stammlösung mit 10 millimolaren Tris verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 millimolaren Kaliumchlorid zu erreichen.
Bewahren Sie die verdünnte Myosinlösung 10 Minuten bei Raumtemperatur auf und übertragen Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Die Motoren sind bis zu zwei Stunden lang voll aktiv. Um den Lösungsmittelfluss durch die Gelporen zu verfolgen, stellen Sie passivierte fluoreszierende Beads her und reduzieren Sie die Wechselwirkung zwischen den Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk, indem Sie einen Mikroliter Beads mit fünf mikromolaren G-Aktinen für 20 Minuten inkubieren.
Entfernen Sie das überschüssige G-Aktin durch Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 10 Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin, um die verbleibende unbeschichtete Oberfläche zu verstopfen, und verwenden Sie die Kügelchen in einer Endverdünnung von eins bis 10.000 in den Experimenten. Zur Herstellung der Aktomyosinlösung werden die bei minus 80 Grad Celsius gelagerten Proteinaliquote aufgetaut und auf Eis gelegt.
Bereiten Sie dann die Lösung so vor, dass eine Endkonzentration von 10 millimolaren Tris, fünf mikromolaren G-Aktinen, 280 nanomolaren GST-Fascin und 1,67 nanomolaren Myosin II erreicht wird.Nehmen Sie eines der Polyethylenglykol-passivierten Deckgläser. Legen Sie einen gefetteten Paraform-Abstandshalter darauf und legen Sie ihn in den Probenhalter. Geben Sie 1,1 Mikroliter der Aktomyosinlösung auf das am Halter montierte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf.
Schrauben Sie den Halter fest, um die Probe zu versiegeln. Setzen Sie den Probenhalter auf das Mikroskop und starten Sie die Erfassung. Bereiten Sie das Mikroskop im Voraus vor, um die anfängliche Erfassungszeit zu verkürzen.
Um die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop abzubilden, visualisieren Sie den gesamten Gelbereich mit einer niedrigen Vergrößerung des 2,5-fachen Objektivs und verfolgen Sie seine makroskopische Kontraktion mit der Zeit. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv, um die Porosität und Struktur des Netzwerks zu charakterisieren und die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks mit der Zeit zu verfolgen. Für die simultane zweifarbige Bildgebung wird das Aktin bei 488 Nanometern und die Myosin-II-Motoren bei 561 Nanometern angeregt und die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera mit einer Dual-Emissions-Apparatur aufgenommen.
Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktin-Gel und die fluoreszierenden Myosin-II-Motoren abzubilden. Für die simultane zweifarbige Bildgebung wird das Aktin bei 488 Nanometern und 2.300 Nanometer Perlen bei 561 Nanometern angeregt. Und zeichnen Sie die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera mit einem Dual-Emission-Gerät auf.
Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktin-Gel und die fluoreszierenden Kügelchen abzubilden. Am ersten Tag wird gezeigt, dass sich das Aktomyosin-Netzwerk wie ein elastisches Material verhält. Eine schematische Darstellung eines Aktomyosin-Netzwerks ist hier dargestellt.
Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Aktinfilamente spontan nukleieren und zu einem isotropen, miteinander verbundenen Netzwerk polymerisieren, das sich mit der Zeit vergröbert und schließlich makroskopisch zusammenzieht. Die Netzwerkanziehung beginnt an der Gelperipherie und breitet sich nach innen in das Gelvolumen aus. Das Gelzentrum ist mit einem C markiert.Die Aktinfilamentbündel bleiben während der Netzwerkkontraktion gerade.
Hier ist die Verteilung des Verhältnisses zwischen der Konturlänge und dem Ende-zu-Ende-Abstand bei T316 Sekunden und T327 Sekunden dargestellt. Das zweite Ziel besteht darin, zu zeigen, dass durch die Kontraktilität von Myosin ein nach außen gerichteter Lösungsmittelfluss erzeugt wird. Das Bild des Gels bei geringer Vergrößerung in Zwischenstadien der Kontraktion ist hier zu sehen.
Diese Kreise markieren die Positionen von vier Perlen. Die Pfeile markieren die globale Richtung der Wulstbewegung. Hier sind die Flugbahnen der neun ausgewählten Perlen dargestellt.
Die Auflösung der Netzwerkporosität und die Bewegung des Lösungsmittels durch die Gelporen in fortgeschrittenen Stadien der Kontraktion sind hier dargestellt. Das dritte Ziel besteht darin, zu zeigen, dass die Spannungsrelaxation durch eine effektive poroelastische Diffusionskonstante gekennzeichnet ist. Draufsicht-Fluoreszenzbilder eines kontrahierenden Aktomyosin-Gels bei geringer Vergrößerung von der Mischzeit bis zum stationären Zustand sind hier zu sehen.
Die Aktomyosin-Netzwerke verhalten sich wie ein poroelastisch aktives Material. Arbeiten Sie bei diesem Verfahren schnell und genau und denken Sie an die Bedeutung der Oberflächenkonservierung.
