פיתחנו גישה חוץ-גופית כדי לאפיין את המכניקה של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל של שלד התא, ובאופן כללי יותר, הציטופלסמה, אשר הוכחו כמתנהגים כחומר פעיל פורואלסטי. שיטה זו מספקת תובנות כיצד התכווצות מיוזין תורמת להופעת זרימת נוזל וכיצד מהירויות רשת וציטוזול מתואמות בזמן ובמרחב. גישה פשוטה זו מאפשרת לנו לחלץ את התכונות המכניות של מערכות המתפתחות באופן דינמי מבלי להשתמש בציוד או טכניקות מתוחכמות שבהן לא ניתן להשתמש בכלים קונבנציונליים כמו AFIM.
שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הריאולוגיה של חומרים פעילים פורואלסטיים ללא קשר לספציפיות של הג'ל הפעיל והנוזל המשובץ. כדי להתחיל, מניחים 10 עד 12 מספר 1.5 זכוכית מכסה במחזיק פוליטטרפלואוראתילן תוצרת בית ולהכין פתרון פיראנה בכוס 400 מיליליטר. הכינו את התמיסה על קרח במכסה מנוע כימי.
מעבירים את המחזיק לכד מלא פיראנה. לאחר שלוש שעות, מעבירים את המחזיק לכוס נקייה מלאה במים מזוקקים כפולים טריים כדי לשטוף את עודפי הפיראנה מהכיסויים ומעבירים את הכד לאמבט סוניקציה ב 80 הרץ ובעוצמה מלאה למשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעמיים נוספות עם מים מזוקקים כפולים טריים.
להמלחה, מעבירים את המחזיק לכוס נקייה מלאה ב -300 מיליליטר מתנול טהור, ואז לאמבט סוניקציה למשך 30 דקות. לאחר מכן להעביר את המחזיק לתוך פתרון סילאן. אטמו את הכד בפרפילם ושמרו אותו במקרר בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך הלילה.
למחרת, להעביר את המחזיק לתוך נקייה מלא 300 מיליליטר של מתנול טהור במשך 15 שניות. יבשו את תחתית המחזיק כדי להסיר את עודפי המתנול והעבירו אותו לכוס נקייה. לאחר מכן מעבירים את הכד לתנור לייבוש מכסי הזכוכית למשך חמש דקות בחום של 120 מעלות.
כדי להשיג פסיבציה של פני השטח, קחו שתי כיסויים לכל ניסוי והניחו אותן בצלוחית פטרי המצופה בשכבת פרפילם שנוקתה בתחילה באתנול. יש לדגור על כל כיסוי עם מיליליטר אחד של מתוקסיפוליאתילן גליקול מלימיד ב-1X PBS למשך שעה אחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. בסוף תהליך הדגירה, מטים את צלחת הפטרי כדי להסיר ולהצמיד.
יש לשטוף כל כיסוי בחמישה מיליליטר מים מזוקקים כפול ולייבש בזרימה של גז חנקן. מכיוון שיש לשמור על הכיסויים רטובים לאחר פסיבציה, הניחו מיד מיליליטר אחד של 10 מילימולר טריס על המשטחים הפגילטיים והשתמשו בכיסויים תוך שעתיים. כדי ליצור אגרגטים מיוזין גדולים, לדלל את תמיסת מלאי מיוזין עם 10 מילימולר Tris כדי להגיע לריכוז סופי של 25 מילימולר אשלגן כלורי.
שמור את תמיסת המיוזין המדוללת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העבר אותה לקרח עד לשימוש. המנועים פעילים באופן מלא עד שעתיים. כדי לעקוב אחר זרימת הממס על פני נקבוביות הג'ל, הכינו חרוזים פלואורסצנטיים פסיביים והפחיתו את האינטראקציה בין החרוזים לרשת האקטומיוזין על ידי דגירה של מיקרוליטר אחד של חרוזים עם חמישה מיקרומולרים G-actin למשך 20 דקות.
הסר את עודף G- actin על ידי צנטריפוגה. חזור על שלב זה עם 10 מיליגרם למיליליטר של אלבומין בסרום בקר כדי לחסום את פני השטח הלא מצופים הנותרים ולהשתמש בחרוזים בדילול סופי של אחד עד 10, 000 בניסויים. כדי להכין את תמיסת האקטומיוזין, הפשירו את החלבון אליציטוטים המאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס והניחו אותם על קרח.
לאחר מכן הכינו את התמיסה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מילימולרית Tris, חמישה מיקרומולרים G-actin, 280 nanomolar GST Fascin, ו 1.67 nanomolar myosin II.Take אחד הפוליאתילן גליקול פסיבי coverslips. מניחים עליו ספייסר פרפורם משומן ומניחים אותו במחזיק הדגימה. הוסף 1.1 מיקרוליטר של תמיסת האקטומיוזין לתלוש הכיסוי המותקן במחזיק והנח את הכיסוי השני למעלה.
הברג את המחזיק כדי לאטום את הדגימה. הניחו את מחזיק הדגימה על המיקרוסקופ והתחילו את הרכישה. הכינו את המיקרוסקופ מראש כדי לקצר את זמן הרכישה הראשוני.
כדי לצלם את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, דמיינו את כל אזור הג'ל באמצעות הגדלות נמוכות של פי 2.5 ועקבו אחר ההתכווצות המקרוסקופית שלו עם הזמן. השתמש במטרה 10X כדי לאפיין את נקבוביות הרשת ומבנהה, ולעקוב אחר הארגון העצמי של הרשת והתכווצות עם הזמן. להדמיה סימולטנית של שני צבעים, הרגש את מנועי האקטין ב-488 ננומטר ואת מנועי מיוזין II ב-561 ננומטר והקלט את התמונות בו-זמנית במצלמת EMCCD באמצעות מנגנון פליטה כפול.
השתמש באותה מערכת הדמיה כדי לצלם בו זמנית את ג'ל האקטין ואת מנועי המיוזין II הפלואורסצנטיים. להדמיה סימולטנית של שני צבעים, לעורר את האקטין ב 488 ננומטר ו 2, 300 ננומטר חרוזים ב 561 ננומטר. והקלט את התמונות בו-זמנית במצלמת EMCCD באמצעות מנגנון פליטה כפול.
השתמש באותה מערכת הדמיה כדי לצלם בו זמנית את ג'ל האקטין ואת החרוזים הפלואורסצנטיים. היום הראשון כולל הדגמה כי רשת האקטומיוזין מתנהגת כחומר אלסטי. ייצוג סכמטי של רשת אקטומיוזין מתואר כאן.
תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראות כי חוטי האקטין מתגרגרים ומתפלמרים באופן ספונטני לרשת איזוטרופית מקושרת המתגבשת עם הזמן ובסופו של דבר מתכווצת באופן מקרוסקופי. משיכת הרשת מתחילה בפריפריית הג'ל ומתפשטת פנימה לתוך תפזורת הג'ל. מרכז הג'ל מסומן באות C.צרורות חוטי האקטין נשארים ישרים במהלך התכווצות הרשת.
ההתפלגות של היחס בין אורך קווי המתאר למרחק מקצה לקצה ב- T316 שניות ו- T327 שניות מוצגת כאן. המטרה השנייה כוללת הדגמה שזרימת ממס כלפי חוץ נוצרת על ידי התכווצות מיוזין. התמונה של הג'ל בהגדלה נמוכה בשלבי ביניים של התכווצות מוצגת כאן.
עיגולים אלה מסמנים את מיקומם של ארבעה חרוזים. החצים מסמנים את הכיוון הגלובלי של תנועת החרוזים. מסלוליהם של תשעת החרוזים שנבחרו מתוארים כאן.
פתרון נקבוביות הרשת ותנועת הממס על פני נקבוביות הג'ל בשלבים מתקדמים של התכווצות מתוארים כאן. המטרה השלישית כוללת הדגמה כי הרפיית מתח מאופיינת בקבוע דיפוזיה פורואלסטי יעיל. תמונות פלואורסצנטיות בתצוגה עליונה של ג'ל אקטומיוזין מתכווץ בהגדלה נמוכה מזמן הערבוב ועד למצב היציב מוצגות כאן.
רשתות האקטומיוזין מתנהגות כחומר פעיל פורואלסטי. בעת ניסיון הליך זה, לעבוד מהר ומדויק ולזכור את החשיבות של שימור פני השטח.
