我们的实验方案允许用户测量 ALDH1A1 活性，这是一种干细胞生物标志物，使用从流式细胞术到活细胞分子成像的各种方式。这种方法的主要优点是探针激活涉及以高信差比为特征的周转响应，以及选择性 ALDH1A1 亚型检测。演示这一程序的将是我实验室的Michael Lee，Sarah Gardner和Rodrigo Tapia Hernandez研究生。
首先，从八孔室载玻片中感兴趣的培养细胞中吸出生长培养基。每孔加入500微升无血清培养基，补充有两微摩尔亚型选择性荧光探针或非反应性对照探针。将载玻片在室温下孵育30分钟。
孵育后，立即进行共聚焦显微镜成像。以 10 倍放大倍率定位细胞。本实验需要FITC通道和透射光通道。
使用透射光通道定位并聚焦细胞，以在整个实验中聚焦在同一 Z 平面上以消除偏差。将激光功率和FITC增益调整到适当的设置，在该设置中，来自控制AlDeSense AM样本的信号可检测性最小，同时在AlDeSense AM样本中仍能看到信号。通过滑动相应的条来调整每个参数。
可能需要调整几次设置才能识别正确的参数。优化后，使用相同的参数完成该细胞系内的其余实验。每个孔拍摄三个图像，每个处理条件总共三个孔并保存图像。
确保仅在平面和孔之间切换时使用透射光通道进行聚焦，以避免偏置。接下来，使用图像处理软件将CZI文件拆分为不同的通道，并计数细胞和荧光细胞的总数。要确定醛脱氢酶1A1阳性细胞的百分比，请将荧光细胞的数量除以每个图像中的细胞总数。
对每个图像进行相同的计数，以避免混淆变量。取出含有培养箱中维持的细胞的T25细胞培养瓶。添加胰蛋白酶进行细胞分离，并使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
然后在15毫升离心管中沉淀细胞，在180G下在25摄氏度下离心5分钟。将细胞重新悬浮在PBS中的一毫升两微摩尔探针或对照探针溶液中。在室温下摇动细胞60分钟，以确保均匀暴露于染料中。
孵育期后，通过在25摄氏度下以180G离心5分钟来沉淀细胞。然后将细胞重新悬浮在0.5毫升PBS中。将细胞通过35微米尼龙网状细胞过滤器运行到放置在冰上的管子上，以去除可能堵塞流式细胞仪的细胞团块。
打开流式细胞仪仪器并运行启动方案。检查鞘液和空腰。用10%漂白剂和水运行生产线，每次五分钟。
然后运行质量控制珠以确保功能正常。在设置选项卡中，为荧光滤光片选择前向散射侧散射和FITC进行。为图形中心附近的主细胞群绘制前向散点区域与侧向散点区域图。
接下来，绘制一个前向散点区域，而不是指示单线的窄水平带的前向散点宽度图。然后绘制FITC面积与前向散射面积图，以观察由亚型选择性荧光开启探针分类的细胞分布。接下来，绘制FITC区域直方图以观察基于FITC的群体变化并确定醛脱氢酶1A1阳性细胞的百分比。
为了优化FITC激光功率，请使用探头运行样品，使直方图曲线的右尾接近最大FITC面积信号。激光功率优化步骤可能必须重复多次，但一旦为实验指定了设置，就不应在样品之间改变激光功率。随后，将样品添加到筛子中，并用对照探针运行它。
应该可以观察到种群偏移以显示最大动态范围。运行每个样品进行 10， 000 次计数，一式三份。完成样品收集后，用10%漂白剂和水运行管线各五分钟，然后关闭仪器。
使用流式细胞术软件处理数据并步态所需的细胞群。使用矩形栅极选择，设置醛脱氢酶1A1负步态，使对照探针样品中99.5%以上的事件发生在该栅极内。其余细胞将被视为醛脱氢酶1A1阳性。
对探针样品应用相同的门。量化醛脱氢酶1A1阴性和1A1阳性的事件数。测定每个细胞系的平均折叠开启次数，以量化总醛脱氢酶1A1活性。
通过调整激光功率和增益来确定每个细胞系中醛脱氢酶1A1阳性细胞的百分比。为了最小化对照AlDeSense AM处理样品中的信号，在AlDeSense AM处理的细胞中优化荧光信号。通过计数醛脱氢酶A1A阳性细胞的数量，测定醛脱氢酶A1A阳性细胞的百分比。
通过应用亚型选择性荧光探针，通过对对照AlDeSense AM处理群体中最亮的细胞的前0.5%进行门控，在每个细胞系内对醛脱氢酶1A1阳性细胞群进行定量。对卵巢癌细胞小组的分析揭示了醛脱氢酶1A1阳性细胞的百分比。从所测试的癌细胞系获得的结果可以得出结论，BG-1具有最低的醛脱氢酶1A1活性和最低的醛脱氢酶1A1阳性群体。
此外，共聚焦成像和流式细胞术显示Caov-3细胞中醛脱氢酶1A1阳性细胞的百分比最大。但细胞系的整体活性仅居第三高。或者，OVCAR-3细胞含有第三高的醛脱氢酶1A1阳性群体，但表现出最高的总活性。
AlDeSense是一种多功能且可推广的探针，用于鉴定永生化细胞系和患者样品中的CSC。我们希望将其视为临床环境中的预后工具。
