通过清除技术对稻田进行深度荧光观察

该方法解决了水稻芽中深度荧光观察的挑战，例如透明溶液的组织渗透有限和共聚焦显微镜下的真实分辨率。这种技术的主要优点是从宏观角度观察许多大组织的结构，即使是硬组织和厚组织的提示，例如成虫芽。该方法适用于广泛植物物种中坚硬和厚组织的深度成像。

它可以帮助加速植物生物学研究中新现象的发现。首先，在不损坏植物的情况下小心地切割根部，并用水清洗以去除污垢。现在，用镊子剥掉旧的外叶。

为避免压碎细胞，请使用滑动运动的单刃剃刀将组织从芽、顶端分生组织或嫩穗切到基部。如果枝条顶端分生组织或嫩圆锥花序的位置不可见，请将其剪得更长。水稻芽的横截面为椭圆形。

使用双刃剃须刀沿其长轴方向薄薄地刮掉椭圆形的一侧。通过样品中白色的外观确认芽顶端分生组织或嫩圆锥花序的位置，并修剪掉多余的组织。将样品放入含有一毫升固定溶液的1.5毫升微量离心管中。

切一块2.5平方厘米的石蜡薄膜，把它揉成球。现在，将这些球放在样品的顶部，以防止它们从固定溶液中漂浮出来。将装有样品的试管放入干燥器中。

关闭干燥器的盖子并启动真空泵以缓慢减压干燥器内部，直到达到负0.095兆帕的压力。在零下0.095兆帕关闭干燥器后，关闭真空泵，让它在室温下静置30分钟。稍微打开干燥器，慢慢将其恢复到大气压。

如果样品被正确固定，它会沉入固定溶液中。如果它没有下沉，请再次降低压力。取出石蜡膜。

盖上盖子，将试管保持在四摄氏度下过夜。使用不起毛的湿巾，从样品中去除多余的固定剂溶液，并将样品固定在带有即时胶水的振动微切片机托盘上。将样品放在托盘上，平坦的一面朝下，在取样过程中被刮掉，并根据固定的样品设置修剪条件。

使用反向或前进按钮以及向上或向下按钮调整样品位置，并在托盘中装满去离子水，直到所有样品都浸入。装满托盘后，按下开始按钮，将修剪后的样品放在装有一滴PBS的载玻片上。在体视显微镜下检查含有目标位点的样品，并将修剪后的样品转移到含有一毫升PBS的多孔板中。

从多孔板中取出PBS。加入新鲜的PBS，静置一分钟。删除 PBS 并添加 CS。将含有样品的多孔板放入干燥器中并盖上盖子。

然后启动真空泵，缓慢地对干燥器内部减压，直到零下 0.09 兆帕。在零下0.09兆帕关闭干燥器后，关闭真空泵，让它在室温下静置一小时。稍微打开干燥器，慢慢将其恢复到大气压。

将去离子水倒入孔之间的间隙中，以防止CS蒸发，并将多孔板在室温下存放在黑暗中以进行清除。当CS变为绿色时，请用新的溶液替换它。未修剪的样品保持绿色，并且在三个月后没有变得透明，CS.In 剥去所有叶子的样品在一周后节点间变成白色，尽管节点保持绿色。

四周后，样品没有变得透明。手工修剪的样品在CS治疗一周后变白，但在四周后不透明。修剪到130微米厚度的样品在CS处理一周后变得半透明。

两周后，样品几乎透明。在节点中，CS治疗一周后的可观察深度为负60微米，两周后为负90微米。在三周时在零下80微米的深度观察到荧光信号，在四周时在零下100微米的深度观察到荧光信号。

在节间，在没有CS处理的情况下，在零下60微米的深度观察到荧光信号。CS治疗一周至三周后可观察到的深度为负90微米，四周后为负100微米。在叶子中，在没有CS处理的情况下在零下90微米的深度观察到荧光信号，但亮度弱于其他组织。

一周后，信号更亮，并在零下120微米的深度观察到。转录因子OS MASU 15 mOrange在幼穗、叶片、节间、节间和花瓣中观察到表达。关键是要找到植物或组织的最佳条件，例如周期和真空压力或位置，以及CS处理，时间，厚度，速度和适当的染色溶液。

定时和固化技术的结合允许在单个切片的多个组织中对基因表达模式和细胞间通讯进行空间时间观察。