刺胞动物模型系统中的染色质免疫沉淀 Exaiptasia diaphana

在 Aiptasia 中建立 ChIP-seq 协议是研究共生刺胞动物表观遗传标志的第一步，以及这些标志如何调节生物体与其环境的相互作用。该方案经过优化，通过增加交联时间和最大限度地减少组织损失，解决了具有挑战性的刺胞动物特征，例如高粘液产生和高水组织比。将海葵收集在 15 毫升的管中，让它们沉淀到管的底部。

或者，在室温下将它们在离心机中旋转几秒钟，最高可达 3， 500 g。然后，用真空泵去除多余的海水。通过将海葵悬浮在 DPBS 中来清洗海葵。

并在洗涤后取下 DPBS。使用镊子或塑料刮刀将海葵转移到0.5%交联缓冲液中，而不使用多余的缓冲液。将它们以每分钟 12 转和 4 摄氏度的速度在旋转器上孵育一小时。

孵育后，从含有海葵的试管中取出0.5%的交联缓冲液。用 1% 的交联缓冲液重新填充试管。并将其在旋转器上以每分钟 12 转和 4 摄氏度的速度孵育过夜。

第二天，除去1%的交联缓冲液后，通过将海葵悬浮在淬灭缓冲液中并将悬浮液在旋转器上以每分钟12转和4摄氏度孵育20分钟来淬灭交联反应。然后，取出淬灭缓冲液，在DPBS中洗涤海葵两次。倒出 DPBS。

并将海葵倒在纸巾上，以去除尽可能多的液体。将一些液氮倒入研钵中，然后用镊子转移海葵。使用研杵，首先小心地打碎组织。

根据需要继续加满液氮，以防止解冻。继续研磨，直到样品变成细粉。使用刮刀收集样品并将其转移到裂解缓冲液中，确保样品在缓冲液中溶解。

让样品在冰上静置一分钟，然后通过倒置混合。接下来，在用裂解缓冲液洗涤 dounce 组织研磨机后，转移样品并用紧密的研杵将其 dounce 20 至 30 次。将样品转移回试管中。

并将其在旋转器上以每分钟 14 转和 4 摄氏度的速度孵育过夜。将样品放入超声仪中，针头位于管底部上方一厘米处，不要接触管壁。启动超声仪，确保样品中没有产生泡沫。

慢慢将输出功率增加到 2，然后再超声处理两分钟。之后，关闭超声仪，将输出功率设置回零，让样品静置并冷却两分钟。根据计划的样品量和免疫沉淀 （IP） 的数量，通过添加 10% Triton X-100 和 100X 蛋白酶抑制剂混合物 （PIC） 分别达到 1% 和 1X 的终浓度来增加总样品量。

将每个 IP 的体积转移到单独的低保留 1.5 毫升管中，用于染色质免疫沉淀 （ChIP），然后进行定量 PCR 或 qPCR。将等效体积的样品放入另一个 1.5 毫升管中作为模拟对照。将 IP 音量的 10% 作为输入控制，并将其存储在零下 20 摄氏度。

向每个 IP 中加入 4 微克抗体组蛋白 3 赖氨酸 4 三甲基化或 H3K4 三甲基化，但不要添加到模拟样品中。将 IP 反应和模拟物在管旋转器上以每分钟 12 转和 4 摄氏度孵育过夜。切掉移液器吸头的尖端以增加其直径。

并将 50 微升磁珠转移到单独的试管中，每个 IP 一个试管，一个用于模拟。向每根管中加入一毫升封闭溶液。并像以前一样将它们在旋转器上孵育 30 分钟。

使用移液管，取出并丢弃封闭溶液上清液，然后用 IP 或模拟反应将珠子从壁上冲洗掉。将混合物放回装有样品的相应低保留管中。像以前一样，将所有试管孵育三个小时。

孵育后，将 IP 和 mock 放在磁性架上，等待大约 10 到 20 秒，让磁铁分离。弃去上清液，加入一毫升低盐洗涤缓冲液。像以前一样孵育试管五分钟后，将它们放回磁性架上。

用低盐取出洗涤缓冲液。加入 1 毫升含高盐的洗涤缓冲液，再孵育 5 分钟。使用移液管取出并丢弃上清液，并用一毫升TE盐缓冲液洗涤。

再次重复清洗并冲洗掉管帽上的所有珠子。丢弃第二个 TE 盐缓冲液洗涤液后，向每个反应中加入 210 微升洗脱缓冲液。悬浮磁珠并在 65 摄氏度下洗脱，以每分钟 700 转的速度摇晃 15 分钟。

将反应物放在磁性架上，收集洗脱液，然后将其放入新鲜的 1.5 毫升管中。接下来，从冰箱中取出输入物，并加入洗脱缓冲液至总体积为 420 微升。通过将所有洗脱液和输入物在 65 摄氏度和每分钟 700 转的温度下孵育过夜，将它们反向交联。

对于 RNA 消化，加入 10 微升 RNase 混合物，并在 42 摄氏度和每分钟 700 转下孵育 30 分钟。对于蛋白质消化，加入 8 微升蛋白酶 K 并在 55 摄氏度和每分钟 700 转下孵育一小时。在通风橱下，向每个锁相凝胶管中加入一个样品和相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合物。

剧烈摇晃试管并短暂涡旋它们，直到它们形成泡沫状的白色层。在 4 摄氏度和 20， 000 克下旋转 10 分钟。检查水相是否清澈。

使用移液管将水相转移到新鲜管中。加入100%乙醇，相当于其中样品体积的两倍，然后摇匀。在零下 20 摄氏度下孵育过夜，或在零下 80 摄氏度下孵育 30 分钟。

通过在 15， 000 g 下旋转样品 30 分钟来沉淀 DNA。小心地倒出上清液，并用一毫升70%乙醇洗涤沉淀。在 4 摄氏度下以最大速度旋转 5 分钟。

在通过移液去除所有乙醇之前，小心地倒出。将沉淀重悬于30微升无核酸酶水中。与组蛋白 3 赖氨酸 4 或 H3K4 的三甲基化相关的 DNA 进行免疫沉淀三甲基化，并通过免疫荧光染色对 E.diaphana 组织切片进行染色。

获得的DNA片段通过测序和qPCR进行分析。对 ChIP-seq 数据进行基于模型的分析确定了 19， 107 个峰。正如H3K4三甲基化所预期的那样，大多数峰位于转录起始位点（TSS）附近，并且TSS两侧的峰计数频率急剧下降，尤其是朝向基因体。

qPCR引物被设计为靶向三个基因各自TSS附近的几个位点。观察到 H3K4 三甲基化相对于输入和模拟对照的高富集。输入百分比在 2.7% 至 10.7% 之间变化，基因和同一基因内的位点的富集不同。

希望了解刺胞动物应对气候危机引起的环境变化的表观遗传调控可以为珊瑚礁的保护和恢复工作提供信息。