O estabelecimento de um protocolo ChIP-seq em Aiptasia é o primeiro passo na investigação dos marcos epigenéticos em cnidários simbióticos e como eles podem regular a interação de um organismo com seu ambiente. O protocolo é otimizado para lidar com características desafiadoras dos cnidários, como alta produção de muco e alta proporção de água para tecido, aumentando o tempo de reticulação e minimizando a perda de tecido. Colete as anêmonas em um tubo de 15 mililitros e deixe-as assentar no fundo do tubo.
Alternativamente, gire-os em uma centrífuga em temperatura ambiente por alguns segundos, indo até 3.500 g. Em seguida, remova o excesso de água do mar com uma bomba de vácuo. Lave as anêmonas suspendendo-as em DPBS.
E remova o DPBS após a lavagem. Usando uma pinça ou uma espátula de plástico, transfira as anêmonas, sem o tampão supérfluo, para o tampão de reticulação de 0,5%. Incube-os por uma hora em um rotador a uma velocidade de 12 rotações por minuto e quatro graus Celsius.
Após a incubação, remova o tampão de reticulação de 0,5% do tubo que contém as anêmonas. Reabasteça o tubo com o tampão de reticulação de 1%. E incube-o em um rotador durante a noite a 12 rotações por minuto e quatro graus Celsius.
No dia seguinte, após remover o tampão de reticulação de 1%, extinguir a reação de reticulação suspendendo as anêmonas no tampão de têmpera e incubando a suspensão em um rotador por 20 minutos a 12 rotações por minuto e quatro graus Celsius. Em seguida, remova o tampão de têmpera e lave as anêmonas duas vezes em DPBS. Transvase o DPBS.
E esvazie as anêmonas em um lenço de papel para remover o máximo de líquido possível. Despeje um pouco de nitrogênio líquido na argamassa e transfira as anêmonas usando uma pinça. Usando o pilão, comece quebrando cuidadosamente o tecido.
Continue enchendo com nitrogênio líquido, conforme necessário, para evitar o descongelamento. Continue moendo até que a amostra se torne um pó fino. Usando uma espátula, colete a amostra e transfira-a para o tampão de lise, garantindo que a amostra se dissolva no tampão.
Deixe a amostra descansar no gelo por um minuto antes de misturá-la por inversão. Em seguida, depois de lavar um moedor de lenços de papel com tampão de lise, transfira a amostra e dounce-a 20 a 30 vezes com um pilão apertado. Transfira a amostra de volta para o tubo.
E incube-o durante a noite em um rotador a 14 rotações por minuto e quatro graus Celsius. Coloque a amostra no sonciador com a agulha um centímetro acima do fundo do tubo e sem tocar nas paredes. Ligue o sonciador e certifique-se de que nenhuma espuma esteja sendo produzida na amostra.
Aumente lentamente a potência de saída para dois e sonice por mais dois minutos. Depois disso, desligue o sonciator, ajuste a potência de saída de volta a zero e deixe a amostra descansar e esfriar por dois minutos. Dependendo do volume da amostra e do número de imunoprecipitações, ou IPs, planejadas, aumente o volume total da amostra adicionando 10% Triton X-100 e 100X Protease Inhibitor Cocktail, ou PIC, às concentrações finais de 1% e 1X, respectivamente.
Transfira o volume de cada IP para um tubo separado de 1,5 mililitro de baixa retenção para imunoprecipitação da cromatina, ou ChIP, seguido de PCR quantitativo ou qPCR. Coloque o volume equivalente da amostra em outro tubo de 1,5 mililitro como um controle simulado. Pegue 10% do volume dos IPs como controle de entrada e armazene-o a menos 20 graus Celsius.
Adicione quatro microgramas de anticorpo histona 3 lisina 4 trimetilação, ou trimetilação H3K4, a cada IP, mas não à simulação. Incube as reações IP e a simulação no rotador do tubo durante a noite a 12 rotações por minuto e quatro graus Celsius. Corte a ponta de uma ponta de pipeta para aumentar seu diâmetro.
E transfira 50 microlitros de esferas magnéticas em tubos separados, um tubo por IP e outro para simulação. Adicione um mililitro de solução de bloqueio a cada tubo. E incube-os em um rotador por 30 minutos, como antes.
Usando uma pipeta, remova e descarte o sobrenadante da solução de bloqueio e lave as esferas da parede com o IP ou reação simulada. Coloque a mistura de volta nos respectivos tubos de baixa retenção contendo as amostras. Incubar todos os tubos, como antes, durante três horas.
Após a incubação, coloque os IPs e simule no rack magnético e aguarde cerca de 10 a 20 segundos para que os ímãs se separem. Descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão de lavagem com baixo teor de sal. Depois de incubar os tubos, como antes, por cinco minutos, coloque-os de volta no rack magnético.
Remova o tampão de lavagem com baixo teor de sal. Adicione um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal e incube por mais cinco minutos. Remova e descarte o sobrenadante usando uma pipeta e lave com um mililitro de tampão de sal TE.
Repita a lavagem mais uma vez e lave todas as contas da tampa do tubo. Depois de descartar a segunda lavagem do tampão de sal TE, adicione 210 microlitros de tampão de eluição a cada reação. Suspenda as esferas magnéticas e elua a 65 graus Celsius, agitando a 700 rotações por minuto por 15 minutos.
Coloque as reações no rack magnético, colete o eluente e coloque-o em um novo tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, remova a entrada do freezer e adicione tampão de eluição a um volume total de 420 microlitros. Reticule todos os eluentes e a entrada incubando-os a 65 graus Celsius e 700 rotações por minuto durante a noite.
Para a digestão do RNA, adicione 10 microlitros de coquetel de RNase e incube a 42 graus Celsius e 700 rotações por minuto por 30 minutos. Para a digestão de proteínas, adicione oito microlitros de Proteinase K e incube a 55 graus Celsius e 700 rotações por minuto durante uma hora. Sob uma hotte, adicionar uma amostra e o mesmo volume de mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico a cada tubo de gel de bloqueio de fase.
Agite os tubos vigorosamente e agite-os brevemente, até formarem uma camada branca espumosa. Gire por 10 minutos a quatro graus Celsius e 20.000 g. Verifique se a fase aquosa está clara.
Transferir a fase aquosa para um tubo novo utilizando uma pipeta. Adicione 100% de etanol, equivalente a duas vezes o volume da amostra, e agite. Incube a menos 20 graus Celsius durante a noite ou a menos 80 graus Celsius por 30 minutos.
Pulverize o DNA girando as amostras por 30 minutos a 15.000 g. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e lavar os pellets com um mililitro de etanol a 70%. Gire na velocidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Decantar cuidadosamente antes de retirar todo o etanol por pipetagem. Ressuspenda os pellets em 30 microlitros de água livre de nuclease. O DNA, associado à trimetilação da histona 3 lisina 4, ou H3K4, foi imunoprecipitado, e os cortes de tecido de E. diaphana foram corados por imunofluorescência.
Os fragmentos de DNA obtidos foram analisados por sequenciamento e qPCR. A análise baseada em modelo dos dados ChIP-seq identificou 19.107 picos. Como esperado para a trimetilação de H3K4, a maioria dos picos estava localizada perto do local de início da transcrição, ou TSS, e a frequência de contagem de picos diminuiu drasticamente em ambos os lados do TSS, especialmente em direção ao corpo do gene.
Os primers de qPCR foram projetados para atingir vários loci próximos ao respectivo TSS de três genes. Foi observado alto enriquecimento da trimetilação de H3K4 em relação aos controles de entrada e simulados. A porcentagem de entrada variou entre 2,7 a 10,7%, com o enriquecimento diferindo entre os genes e os loci dentro do mesmo gene.
Esperançosamente, uma compreensão da regulação epigenética dos cnidários em resposta às mudanças ambientais causadas pela crise climática poderia informar os esforços de conservação e restauração dos recifes de coral.
