Aiptasia'da bir ChIP-seq protokolü oluşturmak, simbiyotik cnidarianlardaki epigenetik işaretleri ve bunların bir organizmanın çevresiyle etkileşimini nasıl düzenleyebileceğini araştırmanın ilk adımıdır. Protokol, çapraz bağlama süresini artırarak ve doku kaybını en aza indirerek yüksek mukus üretimi ve yüksek su-doku oranı gibi zorlu cnidarian özelliklerini ele almak için optimize edilmiştir. Anemonları 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve tüpün dibine çökmelerine izin verin.
Alternatif olarak, oda sıcaklığında bir santrifüjde birkaç saniye döndürün ve 3.500 g'a kadar çıkarın. Daha sonra fazla deniz suyunu bir vakum pompası ile alın. Anemonları DPBS'de askıya alarak yıkayın.
Ve yıkadıktan sonra DPBS'yi çıkarın. Cımbız veya plastik bir spatula kullanarak, anemonları gereksiz tampon olmadan% 0,5 çapraz bağlama tamponuna aktarın. Onları dakikada 12 dönüş hızında ve dört santigrat derece olan bir döndürücü üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.
İnkübasyondan sonra,% 0.5 çapraz bağlama tamponunu anemonları içeren tüpten çıkarın. Tüpü %1 çapraz bağlama tamponu ile yeniden doldurun. Ve gece boyunca dakikada 12 dönüş ve dört santigrat derece ile bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
Ertesi gün,% 1 çapraz bağlama tamponunu çıkardıktan sonra, anemonları söndürme tamponunda askıya alarak ve süspansiyonu dakikada 12 dönüşte ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe ederek çapraz bağlama reaksiyonunu söndürün. Ardından, söndürme tamponunu çıkarın ve anemonları DPBS'de iki kez yıkayın. DPBS'yi boşaltın.
Ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için anemonları bir kağıt mendil üzerine boşaltın. Harcın içine bir miktar sıvı nitrojen dökün ve anemonları cımbız kullanarak aktarın. Havaneli kullanarak, dokuyu dikkatlice parçalayarak başlayın.
Buz çözülmesini önlemek için gerektiği gibi sıvı nitrojen doldurmaya devam edin. Numune ince bir toz haline gelene kadar öğütmeye devam edin. Bir spatula kullanarak numuneyi toplayın ve numunenin tampon içinde çözünmesini sağlayarak lizis tamponuna aktarın.
Numuneyi, ters çevirerek karıştırmadan önce bir dakika buz üzerinde dinlendirin. Daha sonra, bir dounce doku öğütücüyü lizis tamponu ile yıkadıktan sonra, numuneyi aktarın ve sıkı bir havaneli ile 20 ila 30 kez düzleştirin. Numuneyi tekrar tüpe aktarın.
Ve gece boyunca dakikada 14 dönüş ve dört santigrat derece hızla bir döndürücü üzerinde kuluçkaya yatırın. Numuneyi, iğne tüpün altından bir santimetre yukarıda ve duvarlara değmeyecek şekilde sonsiyatöre yerleştirin. Sonyatörü başlatın ve numunede köpük oluşmadığından emin olun.
Çıkış gücünü yavaşça ikiye yükseltin ve iki dakika daha sonikasyon yapın. Bundan sonra, sonsiatörü kapatın, çıkış gücünü tekrar sıfıra ayarlayın ve numunenin iki dakika dinlenmesine ve soğumasına izin verin. Numune hacmine ve planlanan immünopresipitasyon veya IP sayısına bağlı olarak, sırasıyla% 1 ve 1X'lik nihai konsantrasyonlara% 10 ve 100X Triton X-1 ve 100X Proteaz İnhibitör Kokteyli veya PIC ekleyerek toplam numune hacmini artırın.
Her IP için hacmi, kromatin immünopresipitasyonu veya ChIP için ayrı, düşük tutmalı, 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından kantitatif PCR veya qPCR izleyin. Numunenin eşdeğer hacmini, sahte bir kontrol olarak 1,5 mililitrelik başka bir tüpe yerleştirin. Giriş kontrolü olarak IP'lerin hacminin %10'unu alın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Her IP'ye dört mikrogram antikor histon 3 lizin 4 trimetilasyonu veya H3K4 trimetilasyonu ekleyin, ancak alaya değil. IP reaksiyonlarını ve sahte parçayı tüp döndürücü üzerinde gece boyunca dakikada 12 dönüş ve dört santigrat derece inkübe edin. Çapını artırmak için pipet ucunun ucunu kesin.
Ve 50 mikrolitre manyetik boncukları, IP başına bir tüp ve sahte için bir tüp olmak üzere ayrı tüplere aktarın. Her tüpe bir mililitre bloke edici çözelti ekleyin. Ve onları daha önce olduğu gibi 30 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
Bir pipet kullanarak, bloke edici çözelti süpernatanını çıkarın ve atın ve boncukları IP veya sahte reaksiyonla duvardan yıkayın. Karışımı, numuneleri içeren ilgili düşük tutma tüplerine geri yerleştirin. Tüm tüpleri daha önce olduğu gibi üç saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, IP'leri ve mock'u manyetik rafa yerleştirin ve mıknatısların ayrılması için yaklaşık 10 ila 20 saniye bekleyin. Süpernatanı atın ve düşük tuzlu bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Tüpleri daha önce olduğu gibi beş dakika inkübe ettikten sonra, tekrar manyetik rafa yerleştirin.
Düşük tuzlu yıkama tamponunu çıkarın. Yüksek tuzlu bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve beş dakika daha inkübe edin. Süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın ve bir mililitre TE tuz tamponu ile yıkayın.
Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın ve tüp kapağındaki boncukları temizleyin. İkinci TE tuz tamponu yıkamasını attıktan sonra, her reaksiyona 210 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Manyetik boncukları askıya alın ve 65 santigrat derecede elute, 15 dakika boyunca dakikada 700 dönüşte sallayın.
Reaksiyonları manyetik rafa yerleştirin, eluenti toplayın ve 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin. Ardından, girişi dondurucudan çıkarın ve toplam 420 mikrolitre hacme elüsyon tamponu ekleyin. Tüm eluentleri ve girdiyi, gece boyunca 65 santigrat derecede ve dakikada 700 dönüşte inkübe ederek ters çapraz bağlayın.
RNA sindirimi için 10 mikrolitre RNase kokteyli ekleyin ve 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede ve dakikada 700 dönüşte inkübe edin. Protein sindirimi için sekiz mikrolitre Proteinaz K ekleyin ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede ve dakikada 700 dönüşte inkübe edin. Bir çeker ocak altında, her faz kilitli jel tüpüne bir numune ve aynı hacimde fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı ekleyin.
Tüpleri kuvvetlice çalkalayın ve köpüklü beyaz bir tabaka oluşturana kadar kısa bir süre girdaplayın. Dört santigrat derece ve 20.000 g'da 10 dakika döndürün. Sulu fazın temiz olup olmadığını kontrol edin.
Sulu fazı bir pipet kullanarak taze bir tüpe aktarın. İçine numune hacminin iki katına eşdeğer %100 etanol ekleyin ve çalkalayın. Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede veya eksi 80 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Numuneleri 15.000 g'da 30 dakika döndürerek DNA'yı aşağı doğru peletleyin. Dikkatlice, süpernatanı boşaltın ve peletleri bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca maksimum hızda döndürün.
Tüm etanolü pipetleme ile çıkarmadan önce dikkatlice boşaltın. Peletleri 30 mikrolitre nükleaz içermeyen suda tekrar süspanse edin. Histon 3 lizin 4 veya H3K4'ün trimetilasyonu ile ilişkili DNA, trimetilasyon immünopresipite edildi ve E.diaphana doku kesitleri immünofloresan boyama ile boyandı.
Elde edilen DNA fragmanları dizileme ve qPCR ile analiz edildi. ChIP-seq verilerinin model tabanlı analizi, 19.107 tepe noktası tanımladı. H3K4 trimetilasyonu için beklendiği gibi, çoğu tepe noktası transkripsiyonel başlangıç bölgesinin veya TSS'nin yakınında bulunuyordu ve tepe sayısı frekansı, TSS'nin her iki tarafında, özellikle gen gövdesine doğru keskin bir şekilde azaldı.
qPCR primerleri, üç genin ilgili TSS'sine yakın birkaç lokusu hedeflemek üzere tasarlanmıştır. Giriş ve sahte kontrollere göre H3K4 trimetilasyonunun yüksek oranda zenginleştirilmesi gözlendi. Girdi yüzdesi %2.7 ila %10.7 arasında değişmekte olup, zenginleştirme genler ve aynı gen içindeki lokuslar arasında farklılık göstermektedir.
Umarım, iklim krizinin neden olduğu çevresel değişikliklere yanıt olarak cnidarianların epigenetik düzenlemesinin anlaşılması, mercan resiflerini koruma ve restorasyon çabalarını bilgilendirebilir.
