Aiptasia에서 ChIP-seq 프로토콜을 확립하는 것은 공생 자포의 후성유전학적 특징을 조사하고 이러한 특징이 유기체와 환경의 상호 작용을 어떻게 조절할 수 있는지 조사하는 첫 번째 단계입니다. 이 프로토콜은 교차 결합 시간을 늘리고 조직 손실을 최소화함으로써 높은 점액 생성 및 높은 물 대 조직 비율과 같은 까다로운 자포 기능을 해결하도록 최적화되었습니다. 15밀리리터 튜브에 말미잘을 모아 튜브 바닥에 가라앉히도록 합니다.
양자택일로, 실내 온도에 몇 초 동안 분리기에서 그(것)들을 회전시키, 3, 500 g까지 올라가. 그런 다음 진공 펌프로 과도한 해수를 제거하십시오. 말미잘을 DPBS에 매달아 씻으십시오.
그리고 세탁 후 DPBS를 제거하십시오. 핀셋이나 플라스틱 주걱을 사용하여 불필요한 완충액 없이 말미잘을 0.5% 가교 완충액에 옮깁니다. 분당 12회 회전하고 섭씨 4도의 속도로 회전기에서 1시간 동안 배양합니다.
배양 후 말미잘이 들어있는 튜브에서 0.5% 가교 완충액을 제거합니다. 튜브에 1% 가교 완충액을 다시 채웁니다. 그리고 분당 12회전, 섭씨 4도의 회전기로 하룻밤 동안 배양합니다.
다음날, 1% 가교 완충액을 제거한 후, 담금질 완충액에 말미잘을 현탁액에 현탁액을 현탁액을 주입하여 분당 12회 회전, 섭씨 4도에서 20분 동안 배양함으로써 가교 반응을 소멸시킨다. 그런 다음 담금질 완충액을 제거하고 말미잘을 DPBS로 두 번 세척합니다. DPBS를 디캔팅합니다.
그리고 말미잘을 종이 티슈에 비워 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 모르타르에 액체 질소를 붓고 핀셋을 사용하여 말미잘을 옮깁니다. 유봉을 사용하여 조직을 조심스럽게 부수는 것으로 시작하십시오.
해동을 방지하기 위해 필요에 따라 액체 질소를 계속 보충하십시오. 샘플이 미세한 분말이 될 때까지 계속 분쇄합니다. 주걱을 사용하여 샘플을 채취하여 용해 완충액으로 옮겨 시료가 완충액에 용해되도록 합니다.
샘플을 얼음 위에 1분 동안 그대로 두었다가 반전으로 혼합합니다. 다음으로, 용해 완충액으로 dounce 조직 분쇄기를 세척한 후 샘플을 옮기고 단단한 유봉으로 20-30회 두드립니다. 샘플을 튜브로 다시 옮깁니다.
그리고 분당 14회전, 섭씨 4도의 회전기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바늘이 튜브 바닥에서 1cm 위에 있고 벽에 닿지 않도록 하여 샘플을 sonciator에 넣습니다. sonciator를 시작하고 샘플에서 거품이 생성되지 않는지 확인하십시오.
출력 전력을 천천히 2로 늘리고 2분 더 초음파 처리합니다. 그 후, sonciator를 끄고 출력 전력을 다시 0으로 설정 한 다음 sample을 2 분 동안 그대로 놓고 식히십시오. 시료량과 계획된 면역침전 횟수 또는 IP에 따라 최종 농도 1% 및 1X에 각각 10%Triton X-100 및 100X 프로테아제 억제제 칵테일(PIC)을 첨가하여 총 시료량을 늘립니다.
각 IP에 대한 부피를 염색질 면역침전(ChIP)을 위해 별도의 저머무름 1.5밀리리터 튜브로 전송한 다음 정량적 PCR(qPCR)을 수행합니다. 동일한 부피의 샘플을 모의 대조군으로 다른 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다. IP 볼륨의 10%를 입력 컨트롤로 가져와서 섭씨 영하 20도에 저장합니다.
각 IP에 4마이크로그램의 항체 히스톤 3 라이신 4 트리메틸화 또는 H3K4 트리메틸화를 추가하되 모의 패킷에는 추가하지 않습니다. IP 반응과 모의 반응을 튜브 회전기에서 분당 12회 회전하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 피펫 팁의 끝을 잘라 직경을 늘립니다.
그리고 50 마이크로리터의 마그네틱 비드를 IP당 하나의 튜브와 모의 튜브용 튜브로 별도의 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 1밀리리터의 차단 용액을 추가합니다. 그리고 이전과 같이 30분 동안 회전근에서 배양합니다.
피펫을 사용하여 차단 용액 상층액을 제거 및 폐기하고 IP 또는 모의 반응으로 벽에서 비드를 씻어냅니다. 혼합물을 샘플이 들어 있는 각각의 저머무름 튜브에 다시 넣습니다. 이전과 같이 모든 튜브를 3시간 동안 배양합니다.
배양 후 IP와 모의 동물을 마그네틱 랙에 놓고 자석이 분리될 때까지 약 10-20초 동안 기다립니다. 상층액을 버리고 저염으로 세척 완충액 1mL를 추가합니다. 튜브를 배양한 후 이전과 같이 5분 동안 마그네틱 랙에 다시 놓습니다.
저염으로 세척 버퍼를 제거하십시오. 고염으로 세척 완충액 1m리터를 넣고 5분 더 배양합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거 및 폐기하고 TE 염 완충액 1mL로 세척합니다.
세척을 한 번 더 반복하고 튜브 캡에서 구슬을 씻어냅니다. 두 번째 TE 염 완충액 세척을 폐기한 후 각 반응에 210마이크로리터의 용출 완충액을 추가합니다. 마그네틱 비드를 매달고 섭씨 65도에서 용리하여 15분 동안 분당 700회전으로 흔듭니다.
반응물을 마그네틱 랙에 놓고 용리액을 수집한 다음 새 1.5밀리리터 튜브에 넣습니다. 다음으로, 냉동고에서 투입물을 제거하고 용리 버퍼를 총 420마이크로리터의 부피에 추가합니다. 모든 용리액과 투입물을 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 분당 700회 회전하여 배양하여 역가교합니다.
RNA 분해를 위해 10마이크로리터의 RNase 칵테일을 추가하고 섭씨 42도에서 30분 동안 분당 700회 회전하여 배양합니다. 단백질 분해를 위해 8마이크로리터의 Proteinase K를 추가하고 섭씨 55도에서 1시간 동안 분당 700회 회전하여 배양합니다. 흄 후드 아래에서 하나의 샘플과 동일한 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 혼합물을 각 위상 고정 겔 튜브에 추가합니다.
튜브를 세게 흔들고 거품이 많은 흰색 층을 형성할 때까지 잠시 소용돌이칩니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시키고 20, 000g. 수성상이 깨끗한지 확인하십시오.
피펫을 사용하여 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 시료 부피의 2배에 해당하는 100% 에탄올을 넣고 흔듭니다. 밤새 섭씨 영하 20도에서 또는 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 배양합니다.
15, 000 g에 30 분 동안 표본을 회전시켜서 DNA의 아래 펠릿. 조심스럽게, 상층액을 디캔팅하고 70% 에탄올 1밀리리터로 펠릿을 세척합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 최대 속도로 회전합니다.
피펫팅으로 모든 에탄올을 제거하기 전에 조심스럽게 디캔팅합니다. 펠릿을 30마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시킵니다. 히스톤 3 라이신 4 또는 H3K4의 트리메틸화와 관련된 DNA, 트리메틸화는 면역침전되었고, E.diaphana 조직 절편은 면역형광 염색에 의해 염색되었습니다.
얻어진 DNA 단편은 염기서열분석 및 qPCR에 의해 분석하였다. ChIP-seq 데이터의 모델 기반 분석은 19, 107개의 피크를 식별했습니다. H3K4 트리메틸화에 대해 예상한 바와 같이, 대부분의 피크는 전사 시작 부위(TSS) 근처에 위치했으며, 피크 카운트 빈도는 TSS의 양쪽, 특히 유전자체 쪽으로 급격히 감소했습니다.
qPCR 프라이머는 3개 유전자의 각각의 TSS 근처에 있는 여러 유전자좌를 표적으로 하도록 설계되었습니다. 입력 및 모의 대조군에 비해 H3K4 트리메틸화의 높은 농축이 관찰되었습니다. 투입 비율은 2.7%에서 10.7% 사이로 다양했으며, 농축은 유전자와 동일한 유전자 내 유전자좌에 따라 달랐습니다.
기후 위기로 인한 환경 변화에 대응하여 자포동물의 후성유전학적 조절에 대한 이해가 산호초 보존 및 복원 노력에 도움이 될 수 있기를 바랍니다.
