アイプタシアでChIP-seqプロトコルを確立することは、共生刺胞動物のエピジェネティックなランドマークと、これらが生物の環境との相互作用をどのように制御するかを調査するための最初のステップです。このプロトコールは、架橋時間を長くし、組織の損失を最小限に抑えることにより、高い粘液産生や高い水分対組織比など、刺胞動物の困難な特徴に対処するために最適化されています。イソギンチャクを15ミリリットルのチューブに集め、チューブの底に落ち着かせます。
あるいは、室温で数秒間遠心分離機で回転させ、最大3, 500 gまで回転させます。その後、真空ポンプで余分な海水を取り除きます。アネモネをDPBSに懸濁して洗います。
そして、洗浄後にDPBSを取り外します。ピンセットまたはプラスチック製のヘラを使用して、余分なバッファーを使わずに、アネモネを0.5%架橋バッファーに移します。それらを回転子で1分間12回転、摂氏4度の速度で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、イソギンチャクを含むチューブから0.5%架橋バッファーを取り出します。チューブに1%架橋バッファーを補充します。そして、ローテーターで毎分12回転、摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、1%架橋バッファーを除去した後、イソギンチャクをクエンチバッファーに懸濁し、懸濁液をローテーター上で12回転/分、摂氏4度で20分間インキュベートすることにより、架橋反応をクエンチします。次に、クエンチングバッファーを取り外し、アネモネをDPBSで2回洗浄します。DPBSをデカントします。
そして、イソギンチャクを紙のティッシュに空にして、できるだけ多くの液体を取り除きます。モルタルに液体窒素を注ぎ、ピンセットを使用してイソギンチャクを移します。乳棒を使用して、組織を慎重に分割することから始めます。
霜取りを防ぐために、必要に応じて液体窒素を補充し続けます。サンプルが微粉末になるまで粉砕を続けます。スパチュラを使用してサンプルを採取し、溶解バッファーに移し、サンプルがバッファーに溶解することを確認します。
サンプルを氷の上に1分間置いてから、反転して混合します。次に、ダウンスティッシュグラインダーを溶解バッファーで洗浄した後、サンプルを移し、きつい乳棒で20〜30回ダウンスします。サンプルをチューブに戻します。
そして、ローテーターで毎分14回転、摂氏4度で一晩インキュベートします。針をチューブの底から1センチメートル上に置き、壁に触れないようにして、サンプルをソニシエーターに入れます。ソニシエーターを起動し、サンプルに泡が生成されていないことを確認します。
出力電力をゆっくりと2に増やし、さらに2分間超音波処理します。その後、ソニシエーターのスイッチを切り、出力電力をゼロに戻し、サンプルを休ませて2分間冷まします。サンプル量と計画する免疫沈降(IP)の数に応じて、10%Triton X-100および100X Protease Inhibitor Cocktail(PIC)をそれぞれ1%および1Xの最終濃度に追加して、総サンプル量を増やします。
各IPの容量を、クロマチン免疫沈降(ChIP)用の個別の低保持1.5ミリリットルチューブに移し、続いて定量PCR(qPCR)を行います。モックコントロールとして、サンプルの等量を別の1.5ミリリットルチューブに入れます。IPのボリュームの10%を入力コントロールとして、摂氏マイナス20度で保存します。
各 IP に 4 マイクログラムの抗体ヒストン 3 リジン 4 トリメチル化 (H3K4 トリメチル化) を追加しますが、モックには追加しません。IP反応とモックをチューブローテーターで一晩、毎分12回転、摂氏4度でインキュベートします。ピペットチップの先端を切り取って直径を広げます。
また、50マイクロリットルの磁気ビーズを、IPごとに1本、モック用に1本ずつ、別々のチューブに移します。各チューブに1ミリリットルのブロッキング溶液を追加します。そして、前と同じように、それらをローテーターで30分間インキュベートします。
ピペットを使用して、ブロッキング溶液の上清を取り除いて廃棄し、IPまたは模擬反応で壁からビーズを洗い流します。サンプルが入ったそれぞれの低保持チューブにミックスを戻します。前と同じように、すべてのチューブを3時間インキュベートします。
インキュベーション後、IPとモックを磁気ラックに置き、磁石が分離するまで約10〜20秒待ちます。上清を捨て、低塩で1ミリリットルの洗浄緩衝液を追加します。チューブを前回と同様に5分間インキュベートした後、チューブを磁気ラックに戻します。
低塩で洗浄バッファーを取り除きます。高塩分を含む1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、さらに5分間インキュベートします。ピペットを使用して上清を取り出して廃棄し、1ミリリットルのTE塩緩衝液で洗浄します。
もう一度洗浄を繰り返し、チューブキャップからビーズを洗い流します。2回目のTE塩緩衝液洗浄液を廃棄した後、各反応に210マイクロリットルの溶出緩衝液を加えます。磁気ビーズを懸濁し、摂氏65度で溶出させ、毎分700回転で15分間振とうします。
反応液を磁気ラックに置き、溶離液を回収して、新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。次に、フリーザーからインプットを取り出し、溶出バッファーを合計420マイクロリットルまで追加します。すべての溶離液とインプットを逆架橋し、摂氏65度でインキュベートし、毎分700回転で一晩中インキュベートします。
RNA消化のためには、10マイクロリットルのRNaseカクテルを加え、摂氏42度、毎分700回転で30分間インキュベートします。タンパク質の消化には、8マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏55度、毎分700回転で1時間インキュベートします。ドラフトの下に、1つのサンプルと同量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール混合物を各フェーズロックゲルチューブに加えます。
チューブを激しく振って、泡立つ白い層が形成されるまで、チューブを短時間渦巻きにします。摂氏4度と20, 000 gで10分間回転させます。水相が透明であることを確認してください。
ピペットを使用して水相を新しいチューブに移します。サンプル量の2倍に相当する100%エタノールを加えて振とうします。マイナス20°Cで一晩、またはマイナス80°Cで30分間インキュベートします。
サンプルを15, 000 gで30分間回転させることにより、DNAをペレット化します。慎重に、上清をデカントし、ペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗います。最高速度で5分間、摂氏4度で回転します。
ピペッティングですべてのエタノールを除去する前に、慎重にデカントします。ペレットを30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。ヒストン3リジン4、またはH3K4のトリメチル化に関連するDNAを免疫沈降させ、E.diaphana組織切片を免疫蛍光染色により染色しました。
得られたDNA断片をシーケンシングとqPCRにより解析した。ChIP-seqデータのモデルベース解析により、19, 107のピークが同定されました。H3K4トリメチル化について予想されたように、ほとんどのピークは転写開始部位(TSS)の近くに位置しており、ピークカウント頻度はTSSの両側、特に遺伝子体に向かって急激に減少しました。
qPCRプライマーは、3つの遺伝子のそれぞれのTSS近くのいくつかの遺伝子座を標的とするように設計されました。インプットコントロールおよびモックコントロールと比較して、H3K4トリメチル化の高い濃縮が観察されました。インプットの割合は2.7〜10.7%の間で変動し、濃縮度は遺伝子間および同じ遺伝子内の遺伝子座によって異なりました。
うまくいけば、気候危機によって引き起こされた環境変化に応じた刺胞動物のエピジェネティックな調節を理解することで、サンゴ礁の保全と回復の取り組みに役立つ可能性があります。
