Создание протокола ChIP-seq в Aiptasia является первым шагом в исследовании эпигенетических ориентиров у симбиотических книдарий и того, как они могут регулировать взаимодействие организма с окружающей средой. Протокол оптимизирован для устранения сложных книдарийных особенностей, таких как высокая выработка слизи и высокое соотношение воды и тканей, за счет увеличения времени сшивания и минимизации потерь тканей. Соберите анемоны в 15-миллилитровую пробирку и дайте им осесть на дно пробирки.
В качестве альтернативы закрутите их в центрифуге при комнатной температуре в течение нескольких секунд, дойдя до 3 500 г. Затем удалите лишнюю морскую воду с помощью вакуумного насоса. Вымойте анемоны, суспензив их в DPBS.
И снимите DPBS после стирки. С помощью пинцета или пластикового шпателя перенесите анемоны, без лишнего буфера, в 0,5%-ный буфер для сшивания. Инкубируйте их в течение одного часа на ротаторе со скоростью 12 оборотов в минуту и четырех градусов Цельсия.
После инкубации удалите 0,5%-ный сшивающий буфер из трубки, содержащей анемоны. Наполните пробирку 1%-ным буфером для сшивания. И инкубируйте его на ротаторе в течение ночи со скоростью 12 оборотов в минуту и четырьмя градусами Цельсия.
На следующий день, после удаления 1%-ного буфера для сшивания, погасите реакцию сшивания, суспендируя анемоны в буфере для гашения и инкубируя суспензию на ротаторе в течение 20 минут со скоростью 12 оборотов в минуту и четырьмя градусами Цельсия. Затем снимите буфер для гашения и дважды промойте анемоны в DPBS. Сцедите DPBS.
И высыпьте анемоны на бумажную салфетку, чтобы удалить как можно больше жидкости. Налейте в ступку немного жидкого азота и перенесите анемоны с помощью пинцета. Используя пестик, начните с осторожного разламывания ткани.
Продолжайте доливать жидкий азот по мере необходимости, чтобы предотвратить размораживание. Продолжайте растирать до тех пор, пока образец не превратится в мелкий порошок. С помощью шпателя соберите образец и перенесите его в буфер для лизиса, убедившись, что образец растворяется в буфере.
Дайте образцу отдохнуть на льду в течение одной минуты, прежде чем перемешать его путем инверсии. Затем, промыв измельчитель тканей с буфером для лизиса, перенесите образец и обработайте его от 20 до 30 раз тугим пестиком. Перенесите образец обратно в пробирку.
И инкубируйте его в течение ночи на ротаторе со скоростью 14 оборотов в минуту и четырьмя градусами Цельсия. Поместите образец в сосяпочку иглой на один сантиметр выше дна пробирки и не касаясь стенок. Запустите сонциатор и убедитесь, что в образце не образуется пена.
Медленно увеличьте выходную мощность до двух и обрабатывайте ультразвуком еще две минуты. После этого выключите сонциатор, установите выходную мощность обратно на ноль и дайте образцу отдохнуть и остыть в течение двух минут. В зависимости от объема образца и количества запланированных иммунопреципитаций (ВП) увеличьте общий объем образца путем добавления 10% Triton X-100 и 100X Ингибитора Ингибитора Протеазы, или PIC, до конечных концентраций 1% и 1X соответственно.
Перенесите объем для каждого IP-масла в отдельную пробирку объемом 1,5 мл с низким удержанием для иммунопреципитации хроматина, или ChIP, с последующей количественной ПЦР, или qPCR. Поместите эквивалентный объем образца в другую 1,5-миллилитровую пробирку в качестве макета контроля. Возьмите 10% объема IP-адресов в качестве входного управления и сохраните его при температуре минус 20 градусов Цельсия.
Добавьте четыре микрограмма триметилирования гистона гистона 3 или триметилирования H3K4 к каждому IP, но не к макету. Инкубируйте реакции IP и макет на вращателе трубок в течение ночи со скоростью 12 оборотов в минуту и четырех градусов Цельсия. Отрежьте кончик наконечника пипетки, чтобы увеличить его диаметр.
И переложите 50 микролитров магнитных шариков в отдельные пробирки, по одной пробирке на IP и одну для макета. Добавьте по одному миллилитру блокирующего раствора в каждую пробирку. И инкубировать их на ротаторе в течение 30 минут, как и раньше.
С помощью пипетки удалите и выбросьте надосадочную жидкость из раствора блокировки и смойте шарики со стены с помощью реакции IP или имитации. Поместите смесь обратно в соответствующие пробирки с низким уровнем удерживания, содержащие образцы. Инкубируйте все трубки, как и раньше, в течение трех часов.
После инкубации поместите IP-адреса и макет на магнитную стойку и подождите около 10-20 секунд, пока магниты не отделятся. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр буфера для стирки с низким содержанием соли. После инкубации пробирок, как и раньше, в течение пяти минут поместите их обратно на магнитную решетку.
Удалите буфер для стирки с низким содержанием соли. Добавьте один миллилитр промывочного буфера с высоким содержанием соли и выдерживайте еще пять минут. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и промойте одним миллилитром солевого буфера TE.
Повторите промывку еще раз и промойте все шарики из крышки тюбика. После того, как вы отбросите вторую промывку солевого буфера TE, добавьте 210 микролитров элюирующего буфера в каждую реакцию. Подвесьте магнитные шарики и вынимайте при температуре 65 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 700 оборотов в минуту в течение 15 минут.
Поместите реакции на магнитный штатив, соберите элюент и поместите его в свежую 1,5-миллилитровую пробирку. Далее выньте вход из морозилки и добавьте буфер элюирования до общего объема 420 микролитров. Выполните обратную сшивку всех элюентов и входных данных, инкубируя их при температуре 65 градусов Цельсия и 700 оборотах в минуту в течение ночи.
Для расщепления РНК добавьте 10 микролитров коктейля РНКазы и инкубируйте при температуре 42 градуса Цельсия и 700 оборотах в минуту в течение 30 минут. Для переваривания белка добавьте восемь микролитров протеиназы К и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия и 700 оборотах в минуту в течение одного часа. Под вытяжной шкаф добавьте по одному образцу и такой же объем смеси фенола-хлороформа-изоамилового спирта в каждую пробирку с фазовой блокировкой.
Энергично встряхните трубки и коротко перемешайте их, пока они не образуют пенистый белый слой. Крутите в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и 20 000 г. Убедитесь, что водная фаза чистая.
Перенесите водную фазу в свежую пробирку с помощью пипетки. Добавьте 100% этанол, что в два раза больше объема образца, и встряхните. Выдерживать при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи, или при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Гранулируйте ДНК, вращая образцы в течение 30 минут при 15 000 г. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и промойте гранулы одним миллилитром 70%-ного этанола. Вращайтесь на максимальной скорости в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Перед тем как удалить весь этанол с помощью пипетирования, тщательно сцедите его. Ресуспендируйте гранулы в 30 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. ДНК, связанную с триметилированием гистона-3 лизина 4, или H3K4, триметилирование подвергали иммунопреципитации, а участки ткани E.diaphana окрашивали иммунофлуоресцентным окрашиванием.
Полученные фрагменты ДНК были проанализированы методами секвенирования и количественной ПЦР. В результате модельного анализа данных ChIP-seq было выявлено 19 107 пиков. Как и ожидалось для триметилирования H3K4, большинство пиков были расположены вблизи сайта начала транскрипции, или TSS, и частота подсчета пиков резко снизилась по обе стороны TSS, особенно по направлению к телу гена.
Праймеры для количественной ПЦР были разработаны для нацеливания на несколько локусов вблизи соответствующих TSS трех генов. Наблюдалось высокое обогащение триметилирования H3K4 по отношению к входному и фиктивному контролю. Процент входных данных варьировал от 2,7 до 10,7%, при этом обогащение варьировалось в зависимости от гена и локусов в пределах одного и того же гена.
Есть надежда, что понимание эпигенетической регуляции книдариев в ответ на изменения окружающей среды, вызванные климатическим кризисом, может помочь в усилиях по сохранению и восстановлению коралловых рифов.
