ביסוס פרוטוקול ChIP-seq ב-Aiptasia הוא הצעד הראשון בחקירת ציוני הדרך האפיגנטיים בקנידרים סימביוטיים, וכיצד אלה עשויים לווסת את האינטראקציה של אורגניזם עם סביבתו. הפרוטוקול מותאם לטיפול בתכונות צנידאריות מאתגרות, כגון ייצור ריר גבוה ויחס גבוה בין מים לרקמות, על ידי הגדלת זמן הקישור הצולב, ומזעור אובדן רקמות. אספו את שושנות הים בצינור של 15 מיליליטר ותנו להן להתיישב בתחתית הצינור.
לחלופין, סובב אותם בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך כמה שניות, עולה עד 3, 500 גרם. לאחר מכן, הסירו את עודפי מי הים בעזרת משאבת ואקום. שטפו את שושנות הים על ידי השעייתן ב-DPBS.
ולהסיר את DPBS לאחר שטיפה. בעזרת פינצטה או מרית פלסטיק, מעבירים את שושנות הים, ללא החיץ המיותר, למאגר הצולבות של 0.5%. לדגור אותם במשך שעה על מסובב במהירות של 12 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, הסירו את החיץ הצולב של 0.5% מהצינור המכיל את שושנות הים. מלא מחדש את הצינור במאגר קישור צולב של 1%. ולדגור אותו על מסובב לילה ב 12 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, לאחר הסרת חיץ הקישור הצולב, הרוו את תגובת הקישור הצולב, על ידי השהיית שושנות הים במאגר המרווה ודגירת המתלה על מסובב למשך 20 דקות ב-12 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את מאגר המרווה ושטוף את שושנות הים פעמיים ב- DPBS. דקנט את DPBS.
ולרוקן את שושנות הים על ממחטת נייר כדי להסיר כמה שיותר נוזלים. יוצקים מעט חנקן נוזלי למכתש ומעבירים את שושנות הים באמצעות פינצטה. באמצעות pestle, להתחיל על ידי שבירה בזהירות את הרקמה.
המשיכו למלא בחנקן נוזלי, לפי הצורך, כדי למנוע הפשרה. ממשיכים לטחון עד שהדגימה הופכת לאבקה דקה. בעזרת מרית, אספו את הדגימה והעבירו אותה למאגר הליזיס, כדי להבטיח שהדגימה תתמוסס בחיץ.
תן את הדגימה לנוח על קרח במשך דקה אחת לפני ערבוב אותו על ידי היפוך. לאחר מכן, לאחר שטיפת מטחנת רקמות מקפיצה עם חיץ ליזיס, להעביר את הדגימה ולהקפיץ אותו 20 עד 30 פעמים עם מזיק הדוק. העבירו את הדגימה בחזרה לצינור.
ולדגור אותו לילה על מסובב ב 14 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס. מניחים את הדגימה בסונסיאטור עם המחט סנטימטר אחד מעל תחתית הצינור ולא נוגעים בדפנות. הפעל את הסונסיאטור וודא שלא מיוצר קצף בדגימה.
הגדילו לאט את עוצמת הפלט לשתיים והפעילו סוניקציה למשך שתי דקות נוספות. לאחר מכן, לכבות את sonciator, להגדיר את כוח הפלט בחזרה לאפס, ולתת את הדגימה לנוח ולהתקרר במשך שתי דקות. בהתאם לנפח הדגימה ומספר המשקעים החיסוניים, או IPs, המתוכננים, להגדיל את נפח הדגימה הכולל על ידי הוספת 10% Triton X-100 ו 100X Protease Inhibitor קוקטייל, או PIC, לריכוזים סופיים של 1% ו 1X בהתאמה.
העבר את אמצעי האחסון עבור כל IP לתוך צינור נפרד, בעל שימור נמוך, של 1.5 מיליליטר עבור משקעים חיסוניים של כרומטין, או ChIP, ואחריו PCR כמותי, או qPCR. מניחים את הנפח המקביל של הדגימה לתוך צינור נוסף של 1.5 מיליליטר כבקרה מדומה. קח 10% מנפח כתובות ה- IP כפקד הקלט ואחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.
הוסף ארבעה מיקרוגרם של נוגדן היסטון 3 ליזין 4 טרימתילציה, או טרימתילציה H3K4, לכל IP, אך לא לדמה. לדגור על תגובות ה-IP והדמה על מסובב הצינור למשך הלילה ב-12 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס. חותכים את קצה קצה פיפטה כדי להגדיל את הקוטר שלה.
ולהעביר 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לתוך צינורות נפרדים, צינור אחד לכל IP ואחד עבור mock. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה לכל צינור. ולדגור אותם על מסובב במשך 30 דקות, כמו קודם.
באמצעות פיפטה, להסיר ולהשליך את פתרון החסימה supernatant ולשטוף את החרוזים מהקיר עם IP או תגובה מדומה. החזירו את התערובת לצינורות המתאימים בעלי שימור נמוך המכילים את הדגימות. לדגור על כל הצינורות, כמו קודם, במשך שלוש שעות.
לאחר הדגירה, הניחו את כתובות ה-IP והדמה על המדף המגנטי והמתינו כ-10 עד 20 שניות עד שהמגנטים ייפרדו. השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה עם מעט מלח. לאחר הדגירה על הצינורות, כמו קודם, במשך חמש דקות, הניחו אותם בחזרה על המדף המגנטי.
הסירו את מאגר הכביסה עם מעט מלח. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ כביסה עם מלח גבוה ודגרים במשך חמש דקות נוספות. מוציאים ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ושוטפים במיליליטר אחד של חיץ מלח TE.
חזרו על השטיפה פעם נוספת ושטפו את כל החרוזים ממכסה הצינור. לאחר השלכת שטיפת חיץ המלח השנייה של TE, הוסף 210 מיקרוליטר של חיץ אלוציה לכל תגובה. להשעות את החרוזים המגנטיים וללוט ב 65 מעלות צלזיוס, רועד ב 700 סיבובים לדקה במשך 15 דקות.
הניחו את התגובות על המדף המגנטי, אספו את האלואנט והניחו אותו בצינור טרי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, להסיר את הקלט מהמקפיא ולהוסיף מאגר elution לנפח כולל של 420 מיקרוליטר. הפוך להצליב את כל האלונטים ואת הקלט על ידי דגירה עליהם ב 65 מעלות צלזיוס ו 700 סיבובים לדקה במשך הלילה.
לעיכול RNA, להוסיף 10 מיקרוליטר של קוקטייל RNase ולדגור ב 42 מעלות צלזיוס ו 700 סיבובים לדקה במשך 30 דקות. לעיכול חלבונים, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של פרוטאינאז K ודגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס ו-700 סיבובים בדקה למשך שעה. מתחת למכסה אדים, יש להוסיף דגימה אחת ואת אותו נפח של תערובת אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל לכל שפופרת ג'ל נעילת פאזה.
נערו את הצינורות במרץ וערברו אותם לזמן קצר, עד שהם יוצרים שכבה לבנה מקציפה. סובב במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 20, 000 גרם. בדקו שהפאזה המימית ברורה.
מעבירים את הפאזה המימית לצינור טרי באמצעות פיפטה. מוסיפים 100% אתנול, שווה ערך לפי שניים מנפח הדגימה שבו, ומנערים. דוגרים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
גלולה למטה את ה- DNA על ידי סיבוב הדגימות במשך 30 דקות ב 15, 000 גרם. בזהירות, decant את supernatant ולשטוף את הכדורים עם מיליליטר אחד של 70% אתנול. מסתובבים במהירות מרבית במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בזהירות decant לפני הסרת כל אתנול על ידי pipetting. השהה מחדש את הכדוריות ב -30 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. DNA, הקשור לטרימתילציה של היסטון 3 ליזין 4, או H3K4, טרימתילציה הייתה מואצת חיסון, וחלקי רקמת E.diaphana הוכתמו על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית.
מקטעי ה- DNA שהתקבלו נותחו על ידי ריצוף ו- qPCR. הניתוח מבוסס המודל של נתוני ChIP-seq זיהה 19, 107 פסגות. כצפוי עבור טרימתילציה H3K4, רוב הפסגות היו ממוקמות ליד אתר התחלת השעתוק, או TSS, ותדירות ספירת השיא ירדה בחדות משני צידי ה-TSS, במיוחד לכיוון גוף הגן.
פריימרים qPCR תוכננו להתמקד במספר מוקדים ליד TSS בהתאמה של שלושה גנים. נצפתה העשרה גבוהה של טרימתילציה H3K4 ביחס לבקרות הקלט והמדומה. אחוז הקלט נע בין 2.7% ל-10.7%, כאשר ההעשרה הייתה שונה בין הגנים לבין המוקדים בתוך אותו גן.
יש לקוות שהבנה של הרגולציה האפיגנטית של שונית האלמוגים בתגובה לשינויים סביבתיים שנגרמו על ידי משבר האקלים תוכל לסייע במאמצי השימור והשיקום של שוניות האלמוגים.
