يعد إنشاء بروتوكول ChIP-seq في Aiptasia الخطوة الأولى في التحقيق في المعالم اللاجينية في cnidarians التكافلية ، وكيف يمكن أن تنظم تفاعل الكائن الحي مع بيئته. تم تحسين البروتوكول لمعالجة ميزات cnidarian الصعبة ، مثل ارتفاع إنتاج المخاط وارتفاع نسبة الماء إلى الأنسجة ، عن طريق زيادة وقت الربط المتقاطع وتقليل فقدان الأنسجة. اجمع شقائق النعمان في أنبوب سعة 15 ملليلتر واتركها تستقر في قاع الأنبوب.
بدلا من ذلك ، قم بتدويرها في جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لبضع ثوان ، حتى 3،500 جم. ثم قم بإزالة مياه البحر الزائدة باستخدام مضخة تفريغ. اغسل شقائق النعمان بتعليقها في DPBS.
وإزالة DPBS بعد الغسيل. باستخدام ملاقط أو ملعقة بلاستيكية ، انقل شقائق النعمان ، بدون المخزن المؤقت غير الضروري ، إلى المخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 0.5٪. احتضانهم لمدة ساعة واحدة على الدوار بسرعة 12 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 0.5٪ من الأنبوب الذي يحتوي على شقائق النعمان. أعد ملء الأنبوب بمخزن مؤقت للربط المتقاطع بنسبة 1٪. واحتضانها على الدوار بين عشية وضحاها في 12 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، بعد إزالة المخزن المؤقت للربط المتقاطع بنسبة 1٪ ، قم بإخماد تفاعل الربط المتقاطع عن طريق تعليق شقائق النعمان في المخزن المؤقت للتبريد واحتضان التعليق على الدوار لمدة 20 دقيقة عند 12 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت للتبريد واغسل شقائق النعمان مرتين في DPBS. صب DPBS.
وأفرغ شقائق النعمان على منديل ورقي لإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل. صب بعض النيتروجين السائل في الهاون ونقل شقائق النعمان باستخدام ملاقط. باستخدام المدقة ، ابدأ بتفتيت الأنسجة بعناية.
استمر في إضافة النيتروجين السائل ، كما هو مطلوب ، لمنع إذابة الثلج. استمر في الطحن حتى تصبح العينة مسحوقا ناعما. باستخدام ملعقة ، اجمع العينة وانقلها إلى مخزن التحلل المؤقت ، مما يضمن ذوبان العينة في المخزن المؤقت.
اترك العينة ترتاح على الثلج لمدة دقيقة واحدة قبل خلطها عن طريق الانقلاب. بعد ذلك ، بعد غسل مطحنة الأنسجة dounce مع العازلة التحلل ، ونقل العينة و dounce لها 20 إلى 30 مرة مع مدقة ضيقة. انقل العينة مرة أخرى إلى الأنبوب.
واحتضانها طوال الليل على دوار بسرعة 14 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية. ضع العينة في جهاز الصوتنة مع وضع الإبرة سنتيمترا واحدا فوق قاع الأنبوب وعدم لمس الجدران. ابدأ تشغيل جهاز الصوتي وتأكد من عدم إنتاج رغوة في العينة.
قم بزيادة طاقة الخرج ببطء إلى اثنين وصوتنة لمدة دقيقتين أخريين. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل جهاز الصوتنة ، واضبط طاقة الخرج مرة أخرى على الصفر ، واترك العينة ترتاح وتبرد لمدة دقيقتين. اعتمادا على حجم العينة وعدد الترسبات المناعية ، أو عناوين IP ، المخطط لها ، قم بزيادة إجمالي حجم العينة عن طريق إضافة 10٪ Triton X-100 و 100X كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، أو PIC ، إلى التركيزات النهائية 1٪ و 1X على التوالي.
انقل الحجم لكل IP إلى أنبوب منفصل منخفض الاحتفاظ سعة 1.5 ملليلتر للترسيب المناعي للكروماتين ، أو ChIP ، متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أو qPCR. ضع الحجم المكافئ للعينة في أنبوب آخر حجمه 1.5 ملليلتر كعنصر تحكم وهمي. خذ 10٪ من حجم عناوين IP كعنصر تحكم في الإدخال وقم بتخزينه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
أضف أربعة ميكروغرام من الأجسام المضادة هيستون 3 ليسين 4 ثلاثي الميثيل ، أو H3K4 ثلاثي الميثيل ، إلى كل IP ، ولكن ليس إلى وهمية. احتضان تفاعلات IP والوهمية على دوار الأنبوب طوال الليل بسرعة 12 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية. قطع طرف طرف ماصة لزيادة قطرها.
ونقل 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنابيب منفصلة ، أنبوب واحد لكل IP وواحد للوهمية. أضف ملليلتر واحد من محلول الحجب إلى كل أنبوب. واحتضانهم على الدوار لمدة 30 دقيقة ، كما كان من قبل.
باستخدام ماصة ، قم بإزالة وتجاهل طافات محلول الحجب وطرد الخرز من الحائط باستخدام IP أو رد فعل وهمي. ضع المزيج مرة أخرى في الأنابيب ذات الاحتفاظ المنخفض التي تحتوي على العينات. احتضان جميع الأنابيب ، كما كان من قبل ، لمدة ثلاث ساعات.
بعد الحضانة ، ضع عناوين IP ووهمها على الرف المغناطيسي وانتظر حوالي 10 إلى 20 ثانية حتى ينفصل المغناطيس. تخلص من المادة الطافية وأضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل مع ملح منخفض. بعد احتضان الأنابيب ، كما كان من قبل ، لمدة خمس دقائق ، ضعها مرة أخرى على الرف المغناطيسي.
قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل بملح منخفض. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل مع الملح العالي واحتضانه لمدة خمس دقائق أخرى. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها باستخدام ماصة واغسلها بمليلتر واحد من محلول الملح TE.
كرر الغسيل مرة أخرى واطرد أي حبات من غطاء الأنبوب. بعد التخلص من الغسيل العازل الثاني لملح TE ، أضف 210 ميكرولتر من محلول الشطف إلى كل تفاعل. قم بتعليق الحبيبات المغناطيسية والتخلص منها عند 65 درجة مئوية ، مع الاهتزاز بمعدل 700 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
ضع التفاعلات على الرف المغناطيسي ، واجمع المحلول ، وضعه في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإزالة الإدخال من الثلاجة وأضف المخزن المؤقت للشطف إلى حجم إجمالي يبلغ 420 ميكرولتر. قم بالربط العكسي لجميع الشوائب والمدخلات عن طريق احتضانها عند 65 درجة مئوية و 700 دورة في الدقيقة طوال الليل.
لهضم الحمض النووي الريبي ، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل RNase واحتضانه عند 42 درجة مئوية و 700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. لهضم البروتين ، أضف ثمانية ميكرولترات من Proteinase K واحتضانها عند 55 درجة مئوية و 700 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. تحت غطاء الدخان ، أضف عينة واحدة ونفس الحجم من خليط كحول الفينول والكلوروفورم والأيزو أميل إلى كل أنبوب جل قفل الطور.
هز الأنابيب بقوة ودوامة لهم لفترة وجيزة ، حتى تشكل طبقة بيضاء رغوة. تدور لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية و 20،000 غرام. تأكد من أن المرحلة المائية واضحة.
نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة. أضف 100٪ إيثانول ، أي ما يعادل ضعف حجم العينة فيه ، واهتز. احتضان في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بيليه أسفل الحمض النووي عن طريق الغزل العينات لمدة 30 دقيقة في 15،000 غرام. بعناية ، صب الطافد وغسل الكريات مع ملليلتر واحد من الإيثانول 70 ٪. تدور بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
صب بعناية قبل إزالة كل الإيثانول عن طريق ماصة. أعد تعليق الكريات في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. الحمض النووي ، المرتبط بثلاثي ميثيل هيستون 3 ليسين 4 ، أو H3K4 ، تم ترسيب ثلاثي الميثيل مناعيا ، وتم تلطيخ أقسام أنسجة E.diaphana بواسطة تلطيخ مناعي.
تم تحليل شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها عن طريق التسلسل و qPCR. حدد التحليل القائم على النموذج لبيانات ChIP-seq 19،107 قمة. كما هو متوقع لثلاثي ميثيل H3K4 ، كانت معظم القمم تقع بالقرب من موقع بدء النسخ ، أو TSS ، وانخفض تردد عدد الذروة بشكل حاد على جانبي TSS ، خاصة نحو جسم الجين.
تم تصميم بادئات qPCR لاستهداف عدة مواقع بالقرب من TSS الخاص بثلاثة جينات. لوحظ إثراء عالي لثلاثي ميثيل H3K4 بالنسبة إلى عناصر التحكم في الإدخال والوهم. تراوحت النسبة المئوية للمدخلات بين 2.7 إلى 10.7٪ مع اختلاف التخصيب عبر الجينات والمواقع داخل نفس الجين.
نأمل أن يؤدي فهم التنظيم اللاجيني لل cnidarians استجابة للتغيرات البيئية الناجمة عن أزمة المناخ إلى إبلاغ جهود الحفاظ على الشعاب المرجانية واستعادتها.
