Die Etablierung eines ChIP-seq-Protokolls in Aiptasia ist der erste Schritt zur Untersuchung der epigenetischen Orientierungspunkte bei symbiotischen Nesseltieren und wie diese die Interaktion eines Organismus mit seiner Umwelt regulieren können. Das Protokoll ist optimiert, um herausfordernde Nesseltiermerkmale wie eine hohe Schleimproduktion und ein hohes Wasser-Gewebe-Verhältnis zu berücksichtigen, indem die Vernetzungszeit erhöht und der Gewebeverlust minimiert wird. Sammeln Sie die Anemonen in einem 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie am Boden des Röhrchens absetzen.
Alternativ können Sie sie in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur einige Sekunden lang auf 3.500 g schleudern. Entfernen Sie dann das überschüssige Meerwasser mit einer Vakuumpumpe. Waschen Sie die Anemonen, indem Sie sie in DPBS aufhängen.
Und entfernen Sie das DPBS nach dem Waschen. Übertragen Sie die Anemonen mit einer Pinzette oder einem Plastikspatel ohne den überflüssigen Puffer in den 0,5%-Vernetzungspuffer. Inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf einem Rotator bei einer Geschwindigkeit von 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius.
Entfernen Sie nach der Inkubation den 0,5%igen Vernetzungspuffer aus dem Röhrchen mit den Anemonen. Füllen Sie die Tube mit dem 1%-Vernetzungspuffer auf. Und inkubieren Sie es über Nacht auf einem Rotator bei 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag nach Entfernen des 1%-Vernetzungspuffers die Vernetzungsreaktion abschrecken, indem die Anemonen im Quenchpuffer suspendiert und die Suspension auf einem Rotator 20 Minuten lang bei 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius inkubiert wird. Entfernen Sie dann den Quenching-Puffer und waschen Sie die Anemonen zweimal in DPBS. Dekantieren Sie den DPBS.
Und leeren Sie die Anemonen auf ein Papiertaschentuch, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Gießen Sie etwas flüssigen Stickstoff in den Mörser und übertragen Sie die Anemonen mit einer Pinzette. Beginnen Sie mit dem Stößel damit, das Gewebe vorsichtig aufzubrechen.
Füllen Sie bei Bedarf immer wieder flüssigen Stickstoff nach, um ein Auftauen zu verhindern. Mahlen Sie weiter, bis die Probe zu einem feinen Pulver wird. Entnehmen Sie die Probe mit einem Spatel und überführen Sie sie in den Lysepuffer, wobei Sie sicherstellen, dass sich die Probe im Puffer auflöst.
Lassen Sie die Probe eine Minute lang auf Eis ruhen, bevor Sie sie durch Inversion mischen. Nachdem Sie eine Dounce-Gewebemühle mit Lysepuffer gewaschen haben, übertragen Sie die Probe und tupfen Sie sie 20 bis 30 Mal mit einem festen Stößel aus. Übertragen Sie die Probe zurück in das Röhrchen.
Und inkubieren Sie es über Nacht auf einem Rotator bei 14 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius. Legen Sie die Probe mit der Nadel einen Zentimeter über dem Boden des Röhrchens in den Sonciator und berühren Sie nicht die Wände. Starten Sie den Sonciator und stellen Sie sicher, dass in der Probe kein Schaum entsteht.
Erhöhen Sie die Ausgangsleistung langsam auf zwei und beschallen Sie weitere zwei Minuten. Schalten Sie danach den Sonciator aus, stellen Sie die Ausgangsleistung wieder auf Null und lassen Sie die Probe zwei Minuten ruhen und abkühlen. Abhängig vom Probenvolumen und der Anzahl der geplanten Immunpräzipitationen (IPs) erhöhen Sie das Gesamtprobenvolumen, indem Sie 10 % Triton X-100 und 100X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) zu Endkonzentrationen von 1 % bzw. 1X hinzufügen.
Übertragen Sie das Volumen für jede IP in ein separates 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Retention für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR oder qPCR. Geben Sie das entsprechende Volumen der Probe in ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen als Scheinkontrolle. Nehmen Sie 10% der Lautstärke der IPs als Eingangsregler und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.
Fügen Sie vier Mikrogramm Antikörper Histon-3-Lysin-4-Trimethylierung oder H3K4-Trimethylierung zu jedem IP hinzu, jedoch nicht zum Mock. Inkubieren Sie die IP-Reaktionen und den Mock über Nacht auf dem Röhrenrotator bei 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius. Schneide die Spitze einer Pipettenspitze ab, um ihren Durchmesser zu vergrößern.
Und übertragen Sie 50 Mikroliter magnetische Kügelchen in separate Röhrchen, ein Röhrchen pro IP und eines für den Mock. Geben Sie einen Milliliter Verstopfungslösung in jedes Röhrchen. Und inkubieren Sie sie wie zuvor 30 Minuten lang auf einem Rotator.
Entfernen und entsorgen Sie mit einer Pipette den Überstand der Blockierungslösung und spülen Sie die Kügelchen mit der IP- oder Scheinreaktion von der Wand. Geben Sie die Mischung zurück in die entsprechenden Röhrchen mit geringer Retention, die die Proben enthalten. Inkubieren Sie alle Röhrchen wie zuvor drei Stunden lang.
Platzieren Sie nach der Inkubation die IPs und das Mock auf dem Magnetgestell und warten Sie etwa 10 bis 20 Sekunden, bis sich die Magnete getrennt haben. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer mit wenig Salz hinzu. Nachdem Sie die Röhrchen wie zuvor fünf Minuten lang inkubiert haben, legen Sie sie wieder auf das Magnetgestell.
Entfernen Sie den salzarmen Waschpuffer. Fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer mit hohem Salzgehalt hinzu und inkubieren Sie weitere fünf Minuten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie ihn mit einem Milliliter TE-Salzpuffer.
Wiederholen Sie den Waschgang noch einmal und spülen Sie alle Perlen aus dem Tubendeckel aus. Nach dem Verwerfen der zweiten TE-Salzpufferwäsche fügen Sie jeder Reaktion 210 Mikroliter Elutionspuffer hinzu. Suspendieren Sie die magnetischen Kügelchen und eluieren Sie bei 65 Grad Celsius und schütteln Sie 15 Minuten lang mit 700 Umdrehungen pro Minute.
Legen Sie die Reaktionen auf das Magnetgestell, sammeln Sie das Eluent und geben Sie es in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie als Nächstes den Eingang aus dem Gefrierschrank und fügen Sie Elutionspuffer zu einem Gesamtvolumen von 420 Mikrolitern hinzu. Vernetzen Sie alle Eluenten und den Input, indem Sie sie über Nacht bei 65 Grad Celsius und 700 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
Für den RNA-Verdau 10 Mikroliter RNase Cocktail hinzufügen und 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius und 700 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Für die Proteinverdauung fügen Sie acht Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius und 700 Umdrehungen pro Minute. Geben Sie unter einem Abzug eine Probe und das gleiche Volumen eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches in jedes Phasenschloss-Gelröhrchen.
Schütteln Sie die Röhren kräftig und wirbeln Sie sie kurz, bis sie eine schaumige weiße Schicht bilden. 10 Minuten bei vier Grad Celsius und 20.000 g schleudern. Prüfen Sie, ob die wässrige Phase klar ist.
Die wässrige Phase mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen überführen. Fügen Sie 100 % Ethanol hinzu, was dem Doppelten des Probenvolumens entspricht, und schütteln Sie. Inkubieren Sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius oder 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius.
Pelletieren Sie die DNA, indem Sie die Proben 30 Minuten lang bei 15.000 g drehen. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Pellets mit einem Milliliter 70%igem Ethanol. Schleudern Sie fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius.
Dekantieren Sie vorsichtig, bevor Sie das gesamte Ethanol durch Pipettieren entfernen. Resuspendieren Sie die Pellets in 30 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Die Trimethylierung der DNA, die mit der Trimethylierung von Histon 3 Lysin 4 oder H3K4 assoziiert ist, wurde immunpräzipitiert, und die Gewebeschnitte von E.diaphana wurden durch Immunfluoreszenzfärbung gefärbt.
Die gewonnenen DNA-Fragmente wurden mittels Sequenzierung und qPCR analysiert. Die modellbasierte Analyse der ChIP-seq-Daten identifizierte 19.107 Peaks. Wie für die H3K4-Trimethylierung erwartet, befanden sich die meisten Peaks in der Nähe der transkriptionellen Startstelle (TSS), und die Häufigkeit der Peakzählung nahm auf beiden Seiten des TSS stark ab, insbesondere in Richtung des Genkörpers.
qPCR-Primer wurden so konzipiert, dass sie auf mehrere Loci in der Nähe des jeweiligen TSS von drei Genen abzielen. Es wurde eine hohe Anreicherung der H3K4-Trimethylierung im Vergleich zu den Eingangs- und Mock-Kontrollen beobachtet. Der Prozentsatz des Inputs variierte zwischen 2,7 und 10,7 %, wobei sich die Anreicherung je nach Gen und den Loci innerhalb desselben Gens unterschied.
Es bleibt zu hoffen, dass ein Verständnis der epigenetischen Regulation von Nesseltieren als Reaktion auf Umweltveränderungen, die durch die Klimakrise verursacht werden, in die Bemühungen zum Schutz und zur Wiederherstellung von Korallenriffen einfließen könnte.
