Stabilire un protocollo ChIP-seq in Aiptasia è il primo passo per studiare i punti di riferimento epigenetici negli cnidari simbiotici e come questi possano regolare l'interazione di un organismo con il suo ambiente. Il protocollo è ottimizzato per affrontare le caratteristiche impegnative degli cnidari, come l'elevata produzione di muco e un elevato rapporto acqua-tessuto, aumentando il tempo di reticolazione e riducendo al minimo la perdita di tessuto. Raccogli gli anemoni in un tubo da 15 millilitri e lasciali depositare sul fondo del tubo.
In alternativa, centrifugarli in centrifuga a temperatura ambiente per pochi secondi, salendo fino a 3,500 g. Quindi, rimuovere l'acqua di mare in eccesso con una pompa a vuoto. Lavate gli anemoni sospendendoli in DPBS.
E rimuovere il DPBS dopo il lavaggio. Utilizzando una pinzetta o una spatola di plastica, trasferire gli anemoni, senza il tampone superfluo, nel tampone reticolante allo 0,5%. Incubarli per un'ora su un rotatore a una velocità di 12 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone reticolante allo 0,5% dalla provetta contenente gli anemoni. Riempire nuovamente il tubo con il tampone di reticolazione all'1%. E incubarlo su un rotatore durante la notte a 12 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo, dopo aver rimosso il tampone di reticolazione all'1%, estinguere la reazione di reticolazione sospendendo gli anemoni nel tampone di tempra e incubando la sospensione su un rotatore per 20 minuti a 12 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il tampone di tempra e lavare gli anemoni due volte in DPBS. Decantare il DPBS.
E svuotare gli anemoni su un fazzoletto di carta per rimuovere quanto più liquido possibile. Versare un po' di azoto liquido nel mortaio e trasferire gli anemoni con una pinzetta. Usando il pestello, inizia rompendo con cura il tessuto.
Continuare a rabboccare con azoto liquido, se necessario, per evitare lo scongelamento. Continuare a macinare fino a quando il campione non diventa una polvere fine. Utilizzando una spatola, raccogliere il campione e trasferirlo nel tampone di lisi, assicurandosi che il campione si dissolva nel tampone.
Lasciare riposare il campione sul ghiaccio per un minuto prima di mescolare lo stesso per inversione. Successivamente, dopo aver lavato un trituratore di tessuti con tampone di lisi, trasferire il campione e bagnarlo da 20 a 30 volte con un pestello stretto. Trasferire nuovamente il campione nella provetta.
E incubarlo durante la notte su un rotatore a 14 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius. Posizionare il campione nel sonciatore con l'ago un centimetro sopra il fondo della provetta e senza toccare le pareti. Avviare il sonciator e assicurarsi che non venga prodotta schiuma nel campione.
Aumentare lentamente la potenza di uscita a due e sonicare per altri due minuti. Successivamente, spegnere il sonciatore, riportare la potenza di uscita a zero e lasciare riposare e raffreddare il campione per due minuti. A seconda del volume del campione e del numero di immunoprecipitazioni, o IP, pianificate, aumentare il volume totale del campione aggiungendo il 10% di Triton X-100 e 100X di cocktail di inibitori della proteasi, o PIC, a concentrazioni finali rispettivamente dell'1% e dell'1X.
Trasferire il volume per ciascun IP in una provetta separata, a bassa ritenzione, da 1,5 millilitri per l'immunoprecipitazione della cromatina, o ChIP, seguita da PCR quantitativa o qPCR. Posizionare il volume equivalente del campione in un'altra provetta da 1,5 millilitri come controllo simulato. Prendi il 10% del volume degli IP come controllo di ingresso e memorizzalo a meno 20 gradi Celsius.
Aggiungere quattro microgrammi di trimetilazione dell'istone 3 lisina 4 anticorpale, o trimetilazione H3K4, a ciascun IP, ma non al mock. Incubare le reazioni IP e il mock sul rotatore del tubo durante la notte a 12 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius. Tagliare la punta di una pipetta per aumentarne il diametro.
E trasferisci 50 microlitri di perline magnetiche in tubi separati, un tubo per IP e uno per il mock. Aggiungere un millilitro di soluzione bloccante a ciascun tubo. E incubarli su un rotatore per 30 minuti, come prima.
Utilizzando una pipetta, rimuovere ed eliminare il surnatante della soluzione bloccante e sciacquare le perle dalla parete con l'IP o la reazione simulata. Riposizionare la miscela nelle rispettive provette a bassa ritenzione contenenti i campioni. Incubare tutte le provette, come prima, per tre ore.
Dopo l'incubazione, posiziona gli IP e il finto sul rack magnetico e attendi circa 10-20 secondi affinché i magneti si separino. Scartare il surnatante e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale. Dopo aver incubato le provette, come prima, per cinque minuti, riposizionarle sulla rastrelliera magnetica.
Rimuovere il tampone di lavaggio con sale ridotto. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio con sale alto e incubare per altri cinque minuti. Rimuovere ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta e lavare con un millilitro di tampone salino TE.
Ripetere il lavaggio ancora una volta e sciacquare eventuali perline dal tappo del tubo. Dopo aver eliminato il secondo lavaggio del tampone salino TE, aggiungere 210 microlitri di tampone di eluizione a ciascuna reazione. Sospendere le perle magnetiche ed eluire a 65 gradi Celsius, agitando a 700 rotazioni al minuto per 15 minuti.
Posiziona le reazioni sulla rastrelliera magnetica, raccogli l'eluente e mettilo in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Quindi, rimuovere l'ingresso dal congelatore e aggiungere il tampone di eluizione a un volume totale di 420 microlitri. Reticolare inversamente tutti gli eluenti e l'input incubandoli a 65 gradi Celsius e 700 rotazioni al minuto durante la notte.
Per la digestione dell'RNA, aggiungere 10 microlitri di cocktail di RNasi e incubare a 42 gradi Celsius e 700 rotazioni al minuto per 30 minuti. Per la digestione delle proteine, aggiungere otto microlitri di proteinasi K e incubare a 55 gradi Celsius e 700 rotazioni al minuto per un'ora. Sotto una cappa aspirante, aggiungere un campione e lo stesso volume di miscela di fenolo-cloroformio-alcol isoamilico a ciascuna provetta di gel ad aggancio di fase.
Agitare energicamente i tubi e agitarli brevemente, fino a formare uno strato bianco spumoso. Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius e 20.000 g. Verificare che la fase acquosa sia limpida.
Trasferire la fase acquosa in una provetta nuova utilizzando una pipetta. Aggiungere il 100% di etanolo, equivalente a due volte il volume del campione, e agitare. Incubare a meno 20 gradi Celsius durante la notte o a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti.
Pellettare il DNA centrifugando i campioni per 30 minuti a 15.000 g. Decantare accuratamente il surnatante e lavare i pellet con un millilitro di etanolo al 70%. Centrifuga alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Decantare accuratamente prima di rimuovere tutto l'etanolo mediante pipettaggio. Risospendere i pellet in 30 microlitri di acqua priva di nucleasi. La trimetilazione del DNA, associata alla trimetilazione dell'istone 3 lisina 4, o H3K4, è stata immunoprecipitata e le sezioni di tessuto di E. diaphana sono state colorate mediante colorazione immunofluorescente.
I frammenti di DNA ottenuti sono stati analizzati mediante sequenziamento e qPCR. L'analisi basata su modelli dei dati ChIP-seq ha identificato 19.107 picchi. Come previsto per la trimetilazione di H3K4, la maggior parte dei picchi si trovava vicino al sito di inizio trascrizionale, o TSS, e la frequenza di conteggio dei picchi diminuiva bruscamente su entrambi i lati del TSS, specialmente verso il corpo genico.
I primer qPCR sono stati progettati per colpire diversi loci vicino ai rispettivi TSS di tre geni. È stato osservato un elevato arricchimento della trimetilazione di H3K4 rispetto ai controlli di input e mock. La percentuale di input variava tra il 2,7 e il 10,7% con l'arricchimento che differiva tra i geni e i loci all'interno dello stesso gene.
Si spera che una comprensione della regolazione epigenetica degli cnidari in risposta ai cambiamenti ambientali causati dalla crisi climatica possa informare gli sforzi di conservazione e ripristino della barriera corallina.
