L’établissement d’un protocole ChIP-seq chez Aiptasia est la première étape dans l’étude des repères épigénétiques chez les cnidaires symbiotiques et de la manière dont ceux-ci peuvent réguler l’interaction d’un organisme avec son environnement. Le protocole est optimisé pour répondre aux caractéristiques difficiles des cnidaires, telles qu’une production élevée de mucus et un rapport eau/tissu élevé, en augmentant le temps de réticulation et en minimisant la perte de tissus. Récupérez les anémones dans un tube de 15 millilitres et laissez-les se déposer au fond du tube.
Vous pouvez également les faire tourner dans une centrifugeuse à température ambiante pendant quelques secondes, jusqu’à 3 500 g. Ensuite, retirez l’excès d’eau de mer à l’aide d’une pompe à vide. Lavez les anémones en les suspendant dans le DPBS.
Et retirez le DPBS après le lavage. À l’aide d’une pince à épiler ou d’une spatule en plastique, transférez les anémones, sans le tampon superflu, dans le tampon de réticulation à 0,5 %. Incuber pendant une heure sur un rotateur à une vitesse de 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, retirez le tampon de réticulation à 0,5 % du tube contenant les anémones. Remplissez le tube avec le tampon de réticulation à 1 %. Et incubez-le sur un rotateur pendant la nuit à 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius.
Le lendemain, après avoir retiré le tampon de réticulation à 1 %, éteignez la réaction de réticulation en suspendant les anémones dans le tampon de trempe et en incubant la suspension sur un rotateur pendant 20 minutes à 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le tampon de trempe et lavez les anémones deux fois dans DPBS. Décanter le DPBS.
Et videz les anémones sur un mouchoir en papier pour enlever le plus de liquide possible. Versez un peu d’azote liquide dans le mortier et transférez les anémones à l’aide d’une pince à épiler. À l’aide du pilon, commencez par briser soigneusement les tissus.
Continuez à faire l’appoint d’azote liquide, au besoin, pour éviter le dégivrage. Continuez à broyer jusqu’à ce que l’échantillon devienne une poudre fine. À l’aide d’une spatule, prélevez l’échantillon et transférez-le dans le tampon de lyse, en vous assurant que l’échantillon se dissout dans le tampon.
Laissez reposer l’échantillon sur de la glace pendant une minute avant de le mélanger par inversion. Ensuite, après avoir lavé un broyeur de mouchoirs avec un tampon de lyse, transférez l’échantillon et dénoncez-le 20 à 30 fois avec un pilon étanche. Transférez l’échantillon dans le tube.
Et incubez-le pendant la nuit sur un rotateur à 14 rotations par minute et quatre degrés Celsius. Placez l’échantillon dans le sonciateur avec l’aiguille à un centimètre au-dessus du fond du tube et sans toucher les parois. Démarrez le sonciateur et assurez-vous qu’il n’y a pas de mousse produite dans l’échantillon.
Augmentez lentement la puissance de sortie à deux et laissez agir pendant deux minutes supplémentaires. Après cela, éteignez le sonciateur, remettez la puissance de sortie à zéro et laissez l’échantillon se reposer et refroidir pendant deux minutes. En fonction du volume de l’échantillon et du nombre d’immunoprécipitations prévues, augmentez le volume total de l’échantillon en ajoutant 10 % de Triton X-100 et 100X Cocktail d’inhibiteurs de protéase, ou PIC, à des concentrations finales de 1 % et 1X respectivement.
Transférez le volume de chaque IP dans un tube séparé, à faible rétention, de 1,5 millilitre pour l’immunoprécipitation de la chromatine, ou ChIP, suivi d’une PCR quantitative, ou qPCR. Placez le volume équivalent de l’échantillon dans un autre tube de 1,5 millilitre comme témoin fictif. Prenez 10% du volume des IP comme contrôle d’entrée et stockez-le à moins 20 degrés Celsius.
Ajoutez quatre microgrammes d’anticorps histone 3 lysine 4 triméthylation, ou H3K4 triméthylation, à chaque IP, mais pas au simulacre. Incuber les réactions IP et le simulacre sur le rotateur de tube pendant la nuit à 12 rotations par minute et quatre degrés Celsius. Coupez la pointe d’une pointe de pipette pour augmenter son diamètre.
Et transférez 50 microlitres de billes magnétiques dans des tubes séparés, un tube par IP et un pour le simulacre. Ajoutez un millilitre de solution de blocage dans chaque tube. Et incubez-les sur un rotateur pendant 30 minutes, comme précédemment.
À l’aide d’une pipette, retirer et jeter le surnageant de solution de blocage et rincer les billes de la paroi avec l’IP ou la réaction fictive. Remettez le mélange dans les tubes à faible rétention respectifs contenant les échantillons. Incuber tous les tubes, comme précédemment, pendant trois heures.
Après l’incubation, placez les IP et mock sur le support magnétique et attendez environ 10 à 20 secondes pour que les aimants se séparent. Jetez le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon de lavage à faible teneur en sel. Après avoir incubé les tubes, comme précédemment, pendant cinq minutes, remettez-les sur la grille magnétique.
Retirez le tampon de lavage à faible teneur en sel. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage avec beaucoup de sel et incubez pendant cinq minutes de plus. Retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette et lavez-le avec un millilitre de tampon de sel TE.
Répétez le lavage une fois de plus et rincez toutes les perles du capuchon du tube. Après avoir jeté le deuxième tampon de sel TE, ajoutez 210 microlitres de tampon d’élution à chaque réaction. Suspendez les billes magnétiques et éluez à 65 degrés Celsius, en secouant à 700 rotations par minute pendant 15 minutes.
Placez les réactions sur le support magnétique, collectez l’éluant et placez-le dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ensuite, retirez l’entrée du congélateur et ajoutez un tampon d’élution à un volume total de 420 microlitres. Inversez la réticulation de tous les éluants et de l’entrée en les incubant à 65 degrés Celsius et 700 rotations par minute pendant la nuit.
Pour la digestion de l’ARN, ajoutez 10 microlitres de cocktail RNase et incubez à 42 degrés Celsius et 700 rotations par minute pendant 30 minutes. Pour la digestion des protéines, ajoutez huit microlitres de protéinase K et incubez à 55 degrés Celsius et 700 rotations par minute pendant une heure. Sous une hotte, ajoutez un échantillon et le même volume de mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique dans chaque tube de gel à verrouillage de phase.
Secouez vigoureusement les tubes et agitez-les brièvement, jusqu’à ce qu’ils forment une couche blanche mousseuse. Essorer pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et 20 000 g. Vérifiez que la phase aqueuse est claire.
Transférez la phase aqueuse dans un tube frais à l’aide d’une pipette. Ajoutez 100 % d’éthanol, soit l’équivalent de deux fois le volume de l’échantillon, et agitez. Incuber à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit, ou à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Granulez l’ADN en faisant tourner les échantillons pendant 30 minutes à 15 000 g. Décantez soigneusement le surnageant et lavez les granulés avec un millilitre d’éthanol à 70 %. Tournez à vitesse maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Décanter soigneusement avant de retirer tout l’éthanol par pipetage. Remettez les granulés en suspension dans 30 microlitres d’eau sans nucléases. L’ADN, associé à la triméthylation de l’histone 3 lysine 4, ou H3K4, a été immunoprécipité et les coupes de tissu d’E. diaphana ont été colorées par coloration immunofluorescente.
Les fragments d’ADN obtenus ont été analysés par séquençage et qPCR. L’analyse modélisée des données ChIP-seq a permis d’identifier 19 107 pics. Comme prévu pour la triméthylation de H3K4, la plupart des pics étaient situés près du site de début transcriptionnel, ou TSS, et la fréquence du nombre de pics a fortement diminué des deux côtés du TSS, en particulier vers le corps du gène.
Les amorces de qPCR ont été conçues pour cibler plusieurs loci près du TSS respectif de trois gènes. Un enrichissement élevé de la triméthylation de H3K4 par rapport aux témoins d’entrée et simulés a été observé. Le pourcentage d’entrée variait entre 2,7 et 10,7 %, l’enrichissement différant selon les gènes et les loci au sein d’un même gène.
Espérons qu’une compréhension de la régulation épigénétique des cnidaires en réponse aux changements environnementaux causés par la crise climatique pourrait éclairer les efforts de conservation et de restauration des récifs coralliens.
