通过表皮表型评分 鉴定 参与气孔发育的基因

这里介绍的两种表型分析方法提供了高质量的图像，足以进行定量表型分析，并证明肽处理的表型反应与表皮细节。因此，这两种方法可用于了解表皮细胞模式和发育。这两种方法是相对简单可靠的技术，因为它们不需要任何广泛用于表皮表型分析的有毒化学物质或表皮碎片。

然而，这些技术很复杂，需要专门的培训。首先，仔细选择并从单个幼苗中切出一个子叶，这些子叶与盘子上的其他幼苗均匀生长，以限制变异性。使用镊子将每个子叶放入含有一毫升固定溶液的微量离心管中，并将样品在室温下在固定溶液中过夜。

取出固定溶液，加入一毫升70%乙醇。将试管倒置几次，然后将装有样品的试管在室温下放置约 30 分钟。使用一毫升50%乙醇和20%乙醇重复此步骤。

用一毫升蒸馏水代替一毫升20%乙醇，将装有子叶样品的试管倒置几次，放置约30分钟。从管中取出所有蒸馏水，立即加入约200微升甲苯胺蓝O或TBO染色溶液约两分钟。尽可能彻底地去除TBO染色溶液，然后通过加入一毫升新鲜蒸馏水立即洗涤样品几次。

在层流罩中，小心地将两个制备的平板中的每一个的10至12个一日龄拟南芥幼苗移植到每个孔中含有1.5毫升半MS液体培养基的24孔板中。单独加入50毫摩尔三HCL缓冲液或两种不同浓度的肽到含有在半MS琼脂平板上发芽的幼苗的每个孔中。使用移液管将幼苗与单独的缓冲液或肽溶液轻轻混合，并用微孔胶带密封板。

将测定板在22摄氏度的长日照条件下孵育五至七天。在盖玻片上从井中转移幼苗并解剖幼苗的子叶。用镊子将子叶的远轴侧向上放置，并将其切成小块。

取另一张干净的显微镜载玻片，在其上滴一滴碘化丙啶溶液。用镊子将一小块子叶放入液滴中，然后轻轻放置盖玻片。在盖玻片的边缘涂上额外的碘化丙啶溶液，以去除形成的任何气泡。

使用共聚焦显微镜对子叶的远轴侧进行成像，并将图像与仅在含有缓冲液的一半MS培养基中生长的幼苗的图像进行比较。此处显示了来自三种拟南芥基因型、野生型、气孔原沉默系和 epf1 epf2 突变体的 10 天龄幼苗的远轴子叶图像。在这里，气孔原沉默系代表气孔数量少的基因型，epf1 epf2突变体代表气孔数量多的基因型。

采用雌二醇诱导型EPF2或epf1过表达构建体的野生型、TMM型和转基因株系10日龄幼苗子叶的代表性表皮图像进行表皮表皮定量分析。该图显示了在缓冲溶液中生长6至7天的野生型和epf2子叶表皮和用两种不同批次的epf2肽生长的epf2子叶表皮的代表性共聚焦图像。通过执行此过程，请确保从已经与其他幼苗均匀生长的单个幼苗上切下其中一个子叶。

还要选择不接触MS培养基的幼苗以限制变异性。要记住的另一点是，不要在单个微量离心管中放置超过五个子叶。此外，轻轻轻弹试管以确保 TBO 污渍均匀分布在子叶周围，使其染色良好。

考虑到肽溶液中存在多种结构肽，这种生物测定方法对于鉴定正确折叠和生物活性形式的肽及其生物学功能将非常有用。