여기에 제시된 두 가지 표현형 분석 방법은 정량적 표현형 분석을 수행하고 표피 세부 사항으로 펩타이드 처리의 표현형 반응을 입증하기에 충분한 고품질 이미지를 제공합니다. 결과적으로 이 두 가지 방법은 표피 세포 패턴화 및 발달을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 두 가지 방법은 표피 표현형 분석에 널리 사용되는 독성 화학 물질이나 표피 조각이 필요하지 않기 때문에 비교적 쉽고 신뢰할 수 있는 기술입니다.
그러나 기술이 복잡하고 전문 교육이 필요합니다. 시작하려면 변동성을 제한하기 위해 접시의 다른 묘목과 균일하게 자라는 개별 묘목에서 자엽 중 하나를 신중하게 선택하고 잘라냅니다. 집게를 사용하여 고정 용액 1 밀리리터가 들어있는 미세 원심 분리 튜브에 각 자엽을 넣고 샘플을 실온에서 밤새 고정 용액에 두십시오.
고정 용액을 제거하고 1 밀리리터의 70 % 에탄올을 첨가한다. 튜브를 몇 번 뒤집고 샘플이 들어 있는 튜브를 약 30분 동안 실온에 둡니다. 1 밀리리터의 50 % 에탄올을 사용한 다음 20 % 에탄올을 사용하여이 단계를 반복하십시오.
1 밀리리터의 20 % 에탄올을 1 밀리리터의 증류수로 교체하고 자엽 샘플이 들어있는 튜브를 몇 번 뒤집어 약 30 분 동안 그대로 두십시오. 튜브에서 모든 증류수를 제거하고 즉시 약 200 마이크로 리터의 톨루이딘 블루 O 또는 TBO 염색 용액을 약 2 분 동안 첨가하십시오. TBO 염색 용액을 가능한 한 철저하게 제거한 다음 1 밀리리터의 신선한 증류수를 첨가하여 샘플을 즉시 몇 번 세척하십시오.
층류 후드에서, 2개의 준비된 플레이트 각각으로부터 10 내지 12개의 1일 된 애기장대 묘목을 각 웰에 1.5 밀리리터의 반 MS 액체 배지를 함유하는 24-웰 플레이트에 조심스럽게 이식한다. 50 밀리몰 트리스 HCL 완충액 단독으로 또는 두 가지 다른 농도의 펩타이드를 하프 MS 한천 플레이트에서 발아된 묘목을 포함하는 각 웰에 추가합니다. 묘목을 완충액 단독 또는 피펫을 사용하여 펩타이드 용액과 부드럽게 혼합하고 미세 기공 테이프로 플레이트를 밀봉합니다.
분석 플레이트를 섭씨 22도에서 5-7일 동안 긴 하루 조건에서 배양합니다. 덮개 슬라이드의 우물에서 묘목을 옮기고 묘목의 자엽을 해부하십시오. 집게를 사용하여 자엽의 아축 쪽을 위로 올리고 작은 조각으로 자릅니다.
또 다른 깨끗한 현미경 슬라이드를 가져다가 프로피듐 요오드화물 용액 한 방울을 그 위에 놓습니다. 집게를 사용하여 작은 자엽 조각 중 하나를 방울에 넣고 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 커버슬립 가장자리에 요오드화 프로피듐 용액을 추가로 도포하여 형성된 기포를 제거합니다.
컨포칼 현미경을 사용하여 자엽의 축 면을 이미지화하고 버퍼만 포함된 절반 MS 배지에서 자란 묘목의 이미지와 이미지를 비교합니다. 3개의 애기장대 유전자형, 야생형, STOMAGEN 침묵선 및 epf1 epf2 돌연변이체의 10일 된 묘목의 Abaxial cotyledon 이미지가 여기에 표시됩니다. 여기서, STOMAGEN 침묵선은 기공 수가 적은 유전자형을 나타내고, epf1 epf2 돌연변이체는 기공 수가 많은 유전자형을 나타낸다.
에스트라디올 유도성 epf2 또는 epf1 과발현 구조체를 운반하는 야생형, tmm 및 형질전환 계통의 10일 된 묘목에서 자엽의 대표적인 표피 이미지를 표피 표현형의 정량 분석에 사용했습니다. 완충 용액에서 6 내지 7일 동안 성장한 야생형 및 epf2 자엽 표피와 epf2 펩티드의 두 가지 상이한 배치로 성장한 epf2 자엽 표피의 대표적인 공초점 이미지가 이 그림에 나와 있다. 이 절차를 수행하여 이미 다른 묘목과 균일하게 자라고 있는 개별 묘목에서 자엽 중 하나를 잘라야 합니다.
또한 가변성을 제한하기 위해 MS 배지에 닿지 않는 묘목을 선택하십시오. 기억해야 할 또 다른 점은 단일 미세 원심 분리기 튜브에 5 개 이상의 자엽을 넣지 마십시오. 또한 튜브를 부드럽게 튕겨 자엽 주위에 TBO 얼룩이 고르게 분포되도록 하여 잘 염색되도록 합니다.
펩타이드 용액에 여러 구조적 펩타이드가 존재한다는 점을 고려할 때, 이 생물학적 분석 방법은 적절하게 접히고 생리 활성 형태의 펩타이드와 그 생물학적 기능을 식별하는 데 매우 유용할 것입니다.
