Die beiden hier vorgestellten phänotypischen Analysemethoden bieten qualitativ hochwertige Bilder, die für die Durchführung quantitativer phänotypischer Analysen und für die Demonstration phänotypischer Reaktionen der Peptidbehandlung mit epidermalen Details ausreichen. Folglich können diese beiden Methoden verwendet werden, um die Musterung und Entwicklung epidermaler Zellen zu verstehen. Diese beiden Methoden sind relativ einfache und zuverlässige Techniken, da sie keine toxischen Chemikalien oder epidermalen Stücke erfordern, die für die epidermale phänotypische Analyse weit verbreitet sind.
Die Techniken sind jedoch kompliziert und erfordern eine spezielle Ausbildung. Wählen Sie zunächst sorgfältig eines der Keimblätter aus den einzelnen Sämlingen aus und schneiden Sie sie aus, die gleichmäßig mit anderen Sämlingen auf dem Teller wachsen, um die Variabilität zu begrenzen. Legen Sie jedes Keimblatt in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter einer Fixierlösung mit einer Pinzette enthält, und lassen Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur in der Fixierlösung.
Entfernen Sie die Fixierlösung und fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol hinzu. Drehen Sie das Röhrchen ein paar Mal um und lassen Sie das Röhrchen mit den Proben etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem Milliliter 50% Ethanol und dann 20% Ethanol.
Ersetzen Sie den einen Milliliter 20%iges Ethanol durch einen Milliliter destilliertes Wasser, drehen Sie das Röhrchen mit den Keimblattproben einige Male um und lassen Sie es etwa 30 Minuten einwirken. Entfernen Sie das gesamte destillierte Wasser aus dem Röhrchen und fügen Sie sofort etwa 200 Mikroliter Toluidine Blue O- oder TBO-Färbelösung für etwa zwei Minuten hinzu. Entfernen Sie die TBO-Färbelösung so gründlich wie möglich und waschen Sie die Proben dann sofort einige Male, indem Sie einen Milliliter frisches destilliertes Wasser hinzufügen.
Verpflanzen Sie in einer Laminar-Flow-Haube vorsichtig 10 bis 12 einen Tag alte Arabidopsis-Sämlinge von jeder der beiden vorbereiteten Platten in eine 24-Well-Platte, die 1,5 Milliliter flüssiges MS-Medium in jeder Vertiefung enthält. Geben Sie entweder 50 millimolaren Tris-HCL-Puffer allein oder zwei verschiedene Konzentrationen des Peptids in jede Vertiefung, die die auf halben MS-Agarplatten gekeimten Sämlinge enthält. Mischen Sie die Sämlinge vorsichtig mit dem Puffer allein oder einer Peptidlösung mit einer Pipette und verschließen Sie die Platte mit Mikroporenband.
Inkubieren Sie die Testplatte fünf bis sieben Tage lang unter langen Tagesbedingungen bei 22 Grad Celsius. Übertragen Sie den Sämling aus der Vertiefung auf eine Deckfolie und zerlegen Sie das Keimblatt des Sämlings. Legen Sie die abaxiale Seite des Keimblatts mit einer Pinzette nach oben und schneiden Sie es in kleine Stücke.
Nehmen Sie einen weiteren sauberen Objektträger und geben Sie einen Tropfen Propidiumiodidlösung darauf. Legen Sie eines der kleinen Keimblattstücke mit einer Pinzette in den Tropfen und legen Sie das Deckglas vorsichtig auf. Tragen Sie zusätzliche Propidiumiodidlösung auf den Rand des Deckglases auf, um gebildete Luftblasen zu entfernen.
Bilden Sie die abaxiale Seite des Keimblatts mit einem konfokalen Mikroskop ab und vergleichen Sie die Bilder mit den Bildern von Sämlingen, die in einem halben MS-Medium gezüchtet wurden, das nur Puffer enthält. Abaxiale Keimblattbilder von 10 Tage alten Sämlingen von drei Arabidopsis-Genotypen, Wildtyp, einer STOMAGEN-Stummschaltungslinie und epf1-epf2-Mutanten sind hier zu sehen. Hier repräsentiert die stummgeschaltete STOMAGEN-Linie die Genotypen mit einer geringen Anzahl von Stomata und die epf1-epf2-Mutanten die Genotypen mit einer hohen Anzahl von Stomata.
Die repräsentativen Epidermisbilder von Keimblättern von 10 Tage alten Keimlingen von Wildtyp-, tmm- und transgenen Linien, die ein Östradiol-induzierbares epf2- oder epf1-Überexpressionskonstrukt tragen, wurden für die quantitative Analyse des epidermalen Phänotyps verwendet. Die repräsentativen konfokalen Bilder der Wildtyp- und epf2-Keimblattepidermis, die sechs bis sieben Tage in einer Pufferlösung gezüchtet wurden, und einer epf2-Keimblattepidermis, die mit zwei verschiedenen Chargen von epf2-Peptiden gezüchtet wurde, sind in dieser Abbildung dargestellt. Stellen Sie bei diesem Vorgang sicher, dass Sie eines der Keimblätter von einem einzelnen Sämling abschneiden, der bereits gleichmäßig mit den anderen Sämlingen wächst.
Wählen Sie auch einen Sämling, der die MS-Medien nicht berührt, um die Variabilität zu begrenzen. Ein weiterer Punkt, an den Sie sich erinnern sollten, ist, dass Sie nicht mehr als fünf Keimblätter in ein einziges Mikrozentrifugenröhrchen legen. Schnippen Sie auch vorsichtig mit dem Röhrchen, um eine gleichmäßige Verteilung der TBO-Flecken um die Keimblätter herum zu gewährleisten, um sie gut zu färben.
In Anbetracht der Tatsache, dass mehrere strukturelle Peptide in einer Peptidlösung vorhanden sind, wird diese Bioassay-Methode sehr nützlich sein, um richtig gefaltete und bioaktive Formen von Peptiden und ihre biologischen Funktionen zu identifizieren.
