ここで紹介する2つの表現型解析法は、定量的な表現型解析を行い、表皮の詳細を伴うペプチド治療の表現型応答を実証するのに十分な高品質の画像を提供します。したがって、これら2つの方法は、表皮細胞のパターン形成と発生を理解するために使用できます。これらの2つの方法は、表皮表現型分析に広く使用されている有毒化学物質や表皮片を必要としないため、比較的簡単で信頼性の高い技術です。
ただし、テクニックは複雑であり、専門的なトレーニングが必要です。はじめに、プレート上の他の苗と均一に成長している個々の苗から子葉の1つを慎重に選択して切り取り、変動性を制限します。各子葉を鉗子を使用して1ミリリットルの固定液を入れた微小遠心管に入れ、サンプルを固定液中に室温で一晩放置します。
固定液を取り除き、1ミリリットルの70%エタノールを加えます。チューブを数回反転させ、サンプルを含むチューブを室温で約30分間放置します。1ミリリットルの50%エタノールを使用してこのステップを繰り返し、次に20%エタノールを使用します。
1ミリリットルの20%エタノールを1ミリリットルの蒸留水に交換し、子葉サンプルを入れたチューブを数回反転させ、約30分間放置します。チューブからすべての蒸留水を取り除き、すぐに約200マイクロリットルのトルイジンブルーOまたはTBO染色溶液を約2分間加えます。TBO染色液をできるだけ完全に除去してから、すぐに1ミリリットルの新鮮な蒸留水を加えてサンプルを数回洗浄します。
層流フード内で、準備した2枚のプレートのそれぞれから1日齢のシロイヌナズナの苗木10〜12本を、各ウェルに1.5ミリリットルのハーフMS液体培地を含む24ウェルプレートに注意深く移植します。50ミリモルトリスHCL緩衝液単独または2つの異なる濃度のペプチドを、ハーフMS寒天プレート上で発芽した実生を含む各ウェルに加える。苗をバッファー単独またはピペットを使用してペプチド溶液と穏やかに混合し、マイクロポアテープでプレートを密封します。
アッセイプレートを長日条件下で摂氏22度で5〜7日間インキュベートします。カバースライドで井戸から苗を移し、苗の子葉を解剖します。子葉の腹軸側を鉗子で上に置き、細かく切ります。
別のきれいな顕微鏡スライドを取り、その上にヨウ化プロピジウム溶液を一滴置きます。鉗子を使用して子葉の小片の1つをドロップに入れ、カバーガラスをそっと置きます。カバーガラスの端に追加のヨウ化プロピジウム溶液を塗布して、形成された気泡を取り除きます。
共焦点顕微鏡を用いて子葉の腹軸側を撮像し、緩衝液のみを含むハーフMS培地で生育した苗の画像と比較する。シロイヌナズナの3つの遺伝子型、野生型、STOMAGENサイレンスライン、およびepf1 epf2変異体の10日齢苗からの非軸子葉画像を示します。ここで、STOMAGENサイレンスラインは気孔の数が少ない遺伝子型を表し、epf1 epf2変異体は気孔の数が多い遺伝子型を表します。
エストラジオール誘導性epf2またはepf1過剰発現コンストラクトを有する野生型、tmm、およびトランスジェニック系統の10日齢苗の子葉の代表的な表皮画像を表皮表現型の定量分析に使用しました。緩衝溶液中で6〜7日間成長させた野生型およびepf2子葉表皮およびepf2ペプチドの2つの異なるバッチで成長させたepf2子葉表皮の代表的な共焦点画像をこの図に示す。この手順を実行することによって、他の苗とすでに均一に成長している個々の苗から子葉の1つを切り取るようにしてください。
また、変動を制限するためにMS培地に触れない苗を選択してください。覚えておくべきもう一つのポイントは、単一の微量遠心チューブに5つ以上の子葉を入れないことです。また、チューブを軽くフリックして、子葉の周りのTBO染色が均一に分布し、子葉を良好に染色できるようにします。
ペプチド溶液中に複数の構造ペプチドが存在することを考えると、このバイオアッセイ法は、適切に折り畳まれた生理活性型のペプチドとその生物学的機能の同定に非常に役立ちます。
