Los dos métodos de análisis fenotípico presentados aquí ofrecen imágenes de alta calidad que son suficientes para realizar análisis fenotípicos cuantitativos y para demostrar las respuestas fenotípicas del tratamiento con péptidos con detalles epidérmicos. En consecuencia, estos dos métodos se pueden utilizar para comprender el patrón y el desarrollo de las células epidérmicas. Estos dos métodos son técnicas relativamente fáciles y confiables, ya que no requieren ningún producto químico tóxico o pieza epidérmica que se usa ampliamente para el análisis fenotípico epidérmico.
Sin embargo, las técnicas son complicadas y requieren formación especializada. Para comenzar, seleccione cuidadosamente y corte uno de los cotiledones de las plántulas individuales que crecen uniformemente con otras plántulas en el plato para limitar la variabilidad. Coloque cada cotiledón en un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de una solución de fijación con fórceps y deje la muestra en la solución de fijación durante la noche a temperatura ambiente.
Retire la solución de fijación y agregue un mililitro de etanol al 70%. Invierta el tubo un par de veces y deje el tubo que contiene las muestras a temperatura ambiente durante unos 30 minutos. Repita este paso usando un mililitro de 50% de etanol y luego 20% de etanol.
Reemplace el mililitro de etanol al 20% con un mililitro de agua destilada, invierta el tubo que contiene las muestras de cotiledón varias veces y déjelo durante unos 30 minutos. Retire toda el agua destilada del tubo e inmediatamente agregue alrededor de 200 microlitros de solución de tinción Toluidine Blue O o TBO durante unos dos minutos. Retire la solución de tinción TBO lo más completamente posible y luego lave inmediatamente las muestras un par de veces agregando un mililitro de agua destilada fresca.
En una campana de flujo laminar, transplante cuidadosamente de 10 a 12 plántulas de Arabidopsis de un día de edad de cada una de las dos placas preparadas en una placa de 24 pocillos que contenga 1,5 mililitros de medio líquido de medio MS en cada pozo. Agregue 50 milimolares tris HCL tampón solo o dos concentraciones diferentes del péptido a cada pocillo que contenga las plántulas germinadas en la mitad de las placas de agar MS. Mezcle suavemente las plántulas con el tampón solo o una solución peptídica con una pipeta y selle la placa con cinta de microporos.
Incubar la placa de ensayo en condiciones de días largos durante cinco a siete días a 22 grados centígrados. Transfiera la plántula del pozo en un portaobjetos de cubierta y disecte el cotiledón de la plántula. Coloque el lado abaxial del cotiledón con fórceps y córtelo en trozos pequeños.
Tome otro portaobjetos de microscopio limpio y coloque una gota de solución de yoduro de propidio sobre él. Coloque uno de los pequeños trozos de cotiledón en la gota con pinzas y coloque suavemente el cubreobjetos. Aplique una solución adicional de yoduro de propidio en el borde del cubreobjetos para eliminar cualquier burbuja de aire que se forme.
Imagen del lado abaxial del cotiledón usando un microscopio confocal y compare las imágenes con las imágenes de plántulas cultivadas en medio MS que contiene tampón solamente. Aquí se muestran imágenes de cotiledón abaxial de plántulas de 10 días de edad de tres genotipos de Arabidopsis, tipo silvestre, una línea silenciada STOMAGEN y mutantes epf1 epf2. Aquí, la línea silenciada STOMAGEN representa los genotipos con bajo número de estomas y los mutantes epf1 epf2 representan los genotipos con alto número de estomas.
Para el análisis cuantitativo del fenotipo epidérmico se utilizaron las imágenes representativas de la epidermis de cotiledones de plántulas de 10 días de edad de tipo silvestre, tmm y líneas transgénicas que llevaban una construcción de sobreexpresión epf2 o epf1 inducible por estradiol. En esta figura se muestran las imágenes confocales representativas de la epidermis de cotiledón tipo salvaje y epf2 cultivada durante seis a siete días en una solución tampón y una epidermis de cotiledón epf2 cultivada con dos lotes diferentes de péptidos epf2. Al realizar este procedimiento, asegúrese de cortar uno de los cotiledones de una plántula individual que ya está creciendo uniformemente con las otras plántulas.
También elija una plántula que no toque los medios de MS para limitar la variabilidad. Otro punto a recordar es que no coloque más de cinco cotiledones en un solo tubo de microcentrífuga. Además, mueva suavemente el tubo para asegurar una distribución uniforme de las manchas TBO alrededor de los cotiledones para teñirlos bien.
Teniendo en cuenta que existen múltiples péptidos estructurales en una solución peptídica, este método de bioensayo será muy útil para la identificación de formas de péptido correctamente plegadas y bioactivas y sus funciones biológicas.
