Burada sunulan iki fenotipik analiz yöntemi, kantitatif fenotipik analiz yapmak ve epidermal detaylarla peptid tedavisinin fenotipik yanıtlarını göstermek için yeterli olan yüksek kaliteli görüntüler sunmaktadır. Sonuç olarak, bu iki yöntem epidermal hücre paternini ve gelişimini anlamak için kullanılabilir. Bu iki yöntem, epidermal fenotipik analiz için yaygın olarak kullanılan herhangi bir toksik kimyasal veya epidermal parça gerektirmediğinden nispeten kolay ve güvenilir tekniklerdir.
Bununla birlikte, teknikler karmaşıktır ve özel eğitim gerektirir. Başlamak için, değişkenliği sınırlamak için plakadaki diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel fidelerden kotiledonlardan birini dikkatlice seçin ve kesin. Her kotiledonu, forseps kullanarak bir mililitre sabitleme çözeltisi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve numuneyi oda sıcaklığında gece boyunca sabitleme çözeltisinde bırakın.
Sabitleme çözeltisini çıkarın ve bir mililitre% 70 etanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin ve numuneleri içeren tüpü oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika bekletin. Bir mililitre% 50 etanol ve% 20 etanol kullanarak bu adımı tekrarlayın.
Bir mililitre% 20 etanol'ü bir mililitre damıtılmış su ile değiştirin, kotiledon örneklerini içeren tüpü birkaç kez ters çevirin ve yaklaşık 30 dakika bekletin. Tüm damıtılmış suyu tüpten çıkarın ve hemen yaklaşık iki dakika boyunca yaklaşık 200 mikrolitre Toluidin Blue O veya TBO boyama çözeltisi ekleyin. TBO boyama çözeltisini mümkün olduğunca iyice çıkarın ve ardından bir mililitre taze damıtılmış su ekleyerek numuneleri birkaç kez hemen yıkayın.
Laminer bir akış başlığında, hazırlanan iki plakanın her birinden 10 ila 12 adet bir günlük Arabidopsis fidanını, her bir kuyucukta 1,5 mililitre yarım MS sıvı ortamı içeren 24 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice aktarın. Tek başına 50 milimolar tris HCL tamponu veya yarım MS agar plakaları üzerinde çimlenmiş fideleri içeren her bir kuyucuğa iki farklı peptit konsantrasyonu ekleyin. Fideleri tek başına tamponla veya bir pipet kullanarak bir peptit çözeltisiyle yavaşça karıştırın ve plakayı mikro gözenek bandı ile kapatın.
Tahlil plakasını uzun gün koşullarında beş ila yedi gün boyunca 22 santigrat derecede inkübe edin. Fideyi kuyudan bir kapak kaydırağına aktarın ve fidenin kotiledonunu disseke edin. Kotiledonun abaxial tarafını forseps kullanarak yukarı yerleştirin ve küçük parçalara ayırın.
Başka bir temiz mikroskop slaytı alın ve üzerine bir damla propidium iyodür çözeltisi yerleştirin. Forseps kullanarak küçük kotiledon parçalarından birini damlaya yerleştirin ve kapak kaymasını yavaşça yerleştirin. Oluşan hava kabarcıklarını gidermek için kapak kaymasının kenarına ek propidiyum iyodür çözeltisi uygulayın.
Konfokal mikroskop kullanarak kotiledonun abaksiyel tarafını görüntüleyin ve görüntüleri yalnızca tampon içeren yarım MS ortamında yetiştirilen fidelerden elde edilen görüntülerle karşılaştırın. Üç Arabidopsis genotipi, vahşi tip, bir STOMAGEN susturulmuş çizgi ve epf1 epf2 mutantlarının 10 günlük fidelerinden abaxial kotiledon görüntüleri burada gösterilmektedir. Burada, STOMAGEN susturulmuş çizgisi düşük stoma sayısına sahip genotipleri temsil eder ve epf1 epf2 mutantları yüksek sayıda stomaya sahip genotipleri temsil eder.
Epidermal fenotipin kantitatif analizi için 10 günlük yabani tip, tmm ve östradiol ile indüklenebilir epf2 veya epf1 aşırı ekspresyon yapısı taşıyan transgenik çizgilerden elde edilen kotiledonların temsili epidermis görüntüleri kullanılmıştır. Bir tampon çözeltisinde altı ila yedi gün boyunca yetiştirilen vahşi tip ve epf2 kotiledon epidermisinin temsili konfokal görüntüleri ve iki farklı epf2 peptid partisi ile yetiştirilen bir epf2 kotiledon epidermisi bu şekilde gösterilmiştir. Bu prosedürü uygulayarak, kotiledonlardan birini, diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel bir fideden kestiğinizden emin olun.
Ayrıca değişkenliği sınırlamak için MS ortamına dokunmayan bir fide seçin. Hatırlanması gereken bir diğer nokta, tek bir mikrosantrifüj tüpüne beşten fazla kotiledon yerleştirmemektir. Ayrıca, TBO lekelerinin kotiledonların etrafına eşit dağılımını sağlamak için tüpü hafifçe hafifçe hareket ettirin ve onları iyi bir şekilde lekeleyin.
Bir peptit çözeltisinde çoklu yapısal peptitlerin bulunduğu göz önüne alındığında, bu biyotahlil yöntemi, peptidin uygun şekilde katlanmış ve biyoaktif formlarının ve biyolojik işlevlerinin tanımlanması için çok yararlı olacaktır.
