Os dois métodos de análise fenotípica aqui apresentados oferecem imagens de alta qualidade que são suficientes para a realização de análises fenotípicas quantitativas e para demonstrar respostas fenotípicas do tratamento peptídico com detalhes epidérmicos. Consequentemente, esses dois métodos podem ser usados para entender o padrão e o desenvolvimento das células epidérmicas. Esses dois métodos são técnicas relativamente fáceis e confiáveis, pois não requerem produtos químicos tóxicos ou peça epidérmica que seja amplamente utilizada para análise fenotípica epidérmica.
No entanto, as técnicas são complicadas e exigem treinamento especializado. Para começar, selecione cuidadosamente e corte um dos cotilédones das mudas individuais que estão crescendo uniformemente com outras mudas na placa para limitar a variabilidade. Colocar cada cotilédones num tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de uma solução de fixação com pinça e deixar a amostra na solução de fixação durante a noite à temperatura ambiente.
Retire a solução de fixação e adicione um mililitro de etanol a 70%. Inverter o tubo algumas vezes e deixar o tubo que contém as amostras à temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos. Repita este passo usando um mililitro de 50% de etanol e, em seguida, 20% de etanol.
Substitua o mililitro de etanol a 20% por um mililitro de água destilada, inverta o tubo que contém as amostras de cotilédones algumas vezes e deixe-o por cerca de 30 minutos. Retire toda a água destilada do tubo e adicione imediatamente cerca de 200 microlitros de solução de coloração Toluidine Blue O ou TBO por cerca de dois minutos. Remova a solução de coloração TBO o mais completamente possível e, em seguida, lave imediatamente as amostras algumas vezes, adicionando um mililitro de água fresca destilada.
Em um exaustor de fluxo laminar, transplante cuidadosamente 10 a 12 mudas de Arabidopsis de um dia de idade de cada uma das duas placas preparadas em uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de meio meio líquido MS em cada poço. Adicione apenas 50 ml de tampão tris HCL ou duas concentrações diferentes do peptídeo a cada poço contendo as plântulas germinadas em placas de ágar de meia MS. Misture suavemente as mudas com o tampão sozinho ou uma solução peptídica usando uma pipeta e sele a placa com fita de microporos.
Incubar a placa de ensaio em condições de dia longo durante cinco a sete dias a 22 graus Celsius. Transfira a muda do poço em uma lâmina de cobertura e disseque o cotilédones da muda. Coloque o lado abaxial do cotilédones para cima usando fórceps e corte-o em pequenos pedaços.
Pegue outra lâmina de microscópio limpa e coloque uma gota de solução de iodeto de propídio sobre ela. Coloque um dos pequenos pedaços de cotilédones na gota usando fórceps e coloque suavemente a tampa. Aplique uma solução adicional de iodeto de propídio na borda da tampa para remover quaisquer bolhas de ar que são formadas.
Fotografe o lado abaxial do cotilédones usando um microscópio confocal e compare as imagens com as imagens de plântulas cultivadas em meio MS contendo apenas tampão . Imagens de cotilédones abaxiais de mudas de 10 dias de idade de três genótipos de Arabidopsis, tipo selvagem, uma linha silenciada STOMAGEN e mutantes epf1 epf2 são mostradas aqui. Aqui, a linha silenciada STOMAGEN representa os genótipos com baixo número de estômatos e os mutantes epf1 epf2 representam os genótipos com alto número de estômatos.
As imagens representativas da epiderme de cotilédones de plântulas de 10 dias de idade do tipo silvestre, tmm e transgênicas carregando um construto de superexpressão epf2 ou epf1 induzível por estradiol foram utilizadas para a análise quantitativa do fenótipo epidérmico. As imagens confocais representativas do tipo selvagem e epiderme do cotilédones epf2 cultivadas por seis a sete dias em uma solução tampão e uma epiderme de cotilédones epf2 cultivadas com dois lotes diferentes de peptídeos epf2 são mostradas nesta figura. Ao realizar este procedimento, certifique-se de cortar um dos cotilédones de uma muda individual que já está crescendo uniformemente com as outras mudas.
Escolha também uma muda que não toque na mídia MS para limitar a variabilidade. Outro ponto a lembrar é que não coloque mais de cinco cotilédones em um único tubo de microcentrífuga. Além disso, mexa suavemente o tubo para garantir a distribuição uniforme das manchas TBO ao redor dos cotilédones para manchá-los bem.
Considerando que existem múltiplos peptídeos estruturais em uma solução peptídica, este método de bioensaio será muito útil para a identificação de formas de peptídeo adequadamente dobradas e bioativas e suas funções biológicas.
