Hello.Today、何百万ものトウモロコシ葉肉細胞をプロトプラストし、それらを高効率で形質転換するプロトコルを紹介します。プロトコルの主なステップは、最初に植物細胞壁を消化して除去し、プロトプラストを放出し、次にPEGを使用してプロトプラストを変換することです。このプロトコルと他のプロトコルの大きな違いは、変換の規模です。
ほとんどのプロトコルは、1, 000〜10, 000の形質転換プロトプラストで終わる。しかし、私たちのプロトコルは何百万もの形質転換トウモロコシプロトプラストを提供します。ここでは、発芽後9〜11日間暗闇で育てられたトウモロコシの苗があります。
土の高さのすぐ上で苗を切り、水に入れます。使用しないときは、植物を暗所に保管してください。茶色または損傷した領域を持つ葉を除外するように注意しながら、各苗の2番目と3番目の葉を選択します。
12〜16枚の葉を選び、先端から1センチ切り取ります。それから各葉から10センチメートルの部分を切り取ります。基底端を一緒にして、葉のセクションを互いに積み重ねます。
バインダークリップを使用して、基底端でバンドルを一緒にクランプします。葉の束を一枚の白い紙の上に置きます。幅0.5〜1ミリメートルの葉のスライスを切ります。
薄く一貫したスライスをカットすることが重要です。葉束の一部を切断した後、スライスを酵素溶液に移します。材料を乾燥させないでください。
酵素溶液を静かに回転させて材料を濡らします。ビーカーの上にホイルを置き、光を遮断します。バンドル全体がバインダークリップの近くで切り落とされるまで、このプロセスを繰り返します。
切断後、溶液は次のようになります。酵素溶液のビーカーをベルジャーに移します。室温で3分間真空浸潤させる。
卓上シェーカーで40 RPMの室温で2時間半インキュベートします。インキュベーション後、溶液を渦巻きます。それは乳白色に見えるはずで、消化が成功したことを示します。
卓上シェーカーで室温で80 RPMでさらに10分間インキュベートします。酵素溶液を入れたビーカーを氷の上に置きます。氷冷MMGを1容量加えて消化を停止します。
40ミクロンのセルストレーナーを通して50ミリリットルの遠沈管にろ過します。溶液をそれぞれ10ミリリットル以下のアリコートに分割します。冷やした丸底ガラス管に注ぎます。
チューブを100 Gで4分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清を取り除きます。再懸濁してから、後続の洗浄のためにサンプルをプールします。
プロトプラストを5ミリリットルのMMGで2回洗浄する。毎回100Gで3分間スピンダウンします。ペレットは美しく、鮮やかな黄緑色でなければなりません。
チューブを穏やかに回転させることで、ペレットを再懸濁することができます。1ミリリットルのMMGに再懸濁し、カウントのために少量のアリコートを10〜20倍に希釈します。.プロトプラストはすぐに落ち着くので、アリクアウトの前に十分に再懸濁することが重要です。
希釈したプロトプラストを血球計算盤にロードします。光学顕微鏡下でプロトプラストを数えます。良い準備は、洗濯後に余分な破片があまり浮かぶことはありません。
良いプロトプラストは目に見える色素体を持つ円形です。セル数を使用して、合計数を計算します。この準備により、1,000万個を超えるプロトプラストが得られました。
フルオレセインジアセテート染料を使用して生存率を確認することをお勧めします。プロトプラストの単離に成功すると、70〜90%の生存率が得られますプロトプラストを目的のプラスミドと混合します。この例では、100万個のプロトプラストと15マイクログラムのDNAを使用しています。
氷上で30分間インキュベートします。チューブの側面をタップして再懸濁します。PEG溶液を加えて、最終濃度12%PEGに到達します。
数回反転させて穏やかに混ぜます。プロトプラストとPEG溶液は壊れやすいので、チューブを振らないでください。暗所で室温で10分間インキュベートします。
5倍量のインキュベーション溶液で希釈し、転倒して穏やかに混合します。チューブを100 Gで4分間遠心分離します。1ミリリットルのインキュベーションバッファーで1回洗浄します。
ペレットを乱さないように注意してください。100 Gで3分間スピンダウンします。インキュベーションバッファーに再懸濁して、マイクロリットルあたり500〜1000細胞の濃度にします。
室温で一晩暗所でインキュベートします。翌日、100Gで4分間スピンダウンします。冷やしたインキュベーション溶液で2回洗浄します。
室温で100Gで3分間毎回スピンダウンします。再懸濁してから、最終チェックのために少量のアリコートを血球計算盤にロードします。まず、明視野下でプロトプラストの総数を数えます。
次に、UV下で蛍光を発するプロトプラストの割合を観察して、トランスフェクションを検証します。プロトプラストはGFPレポーターを表現しています。それでは、トランスフェクション効率に関するいくつかの指標を入手しましょう。
この準備では、合計1,000万個のプロトプラストを取得し、そのうち100万個をトランスフェクトしました。翌日、335, 000を回収しました。そのうち、形質転換率は30.3%で、GFPを発現するプロトプラストの合計は約100, 000個になります。
トランスフェクション効率はさまざまです。グラフでわかるように、繰り返しの準備の中で20〜50%の効率が日常的に見られます。このプロトコルは、何百万ものトウモロコシ葉肉プロトプラストの収集と形質転換を可能にします。
プロトコルの最も優れた部分の1つは、スケールアップする能力です。形質転換に使用されるプロトプラストの量と数をスケーリングすることにより、今日示したものから桁違いに形質転換を増やすことができます。現在までに、私たちの最大のシングルチューブ実験は、2,000万個のプロトプラストと200マイクログラムのDNAで始まり、翌日には310万個の形質転換プロトプラストで終了しました。
このハイスループットプロトコルは、多くの異なるプラスミド構築物をテストする必要がある場合に特に役立ちますが、共同研究者は、合成遺伝子回路やトウモロコシの設計など、スケールアップ機能を必要としない目的でこのプロトコルを使用しています。私たちのビデオを見ていただきありがとうございます。お役に立てば幸いです。
