Hello.Today אנחנו הולכים להראות לכם פרוטוקול שמייצר פרוטופלסטים של מיליוני תאי מזופיל תירס, ולהפוך אותם ביעילות גבוהה. השלבים העיקריים של הפרוטוקול הם תחילה לעכל ולהסיר את דופן התא הצמח, לשחרר את הפרוטופלסטים, ולאחר מכן להפוך את הפרוטופלסט באמצעות PEG. ההבדל הגדול בין פרוטוקול זה לאחרים הוא קנה המידה של הטרנספורמציה.
רוב הפרוטוקולים בסופו של דבר עם בין 1, 000 ל 10, 000 protoplasts מותמר. עם זאת, הפרוטוקול שלנו נותן מיליוני פרוטופלסטים של תירס שעבר טרנספורמציה. כאן יש לנו שתילי תירס שגדלו בחושך במשך תשעה עד 11 ימים לאחר הנביטה.
חותכים את השתילים ממש מעל פני הקרקע ומניחים במים. יש לשמור את הצמחים בחושך כאשר הם אינם בשימוש. בחר את העלים השני והשלישי של כל שתיל, דואג להוציא עלים עם אזורים חומים או פגומים.
בחרו 12 עד 16 דפים, וחתכו סנטימטר מהקצוות. לאחר מכן חותכים קטע של 10 ס"מ מכל עלה. ערמו את חלקי העלים זה על גבי זה עם קצוות הבסיס יחד.
הדקו את הצרור יחד בקצה הבסיס באמצעות תפס קלסר. מניחים את צרור העלים על פיסת נייר לבן. חותכים פרוסות עלים ברוחב 0.5 עד מילימטר.
חשוב לחתוך פרוסות דקות ועקביות. לאחר חיתוך חלק מצרור העלים, מעבירים את הפרוסות לתמיסת האנזים. אל תאפשרו לחומר להתייבש.
מערבלים בעדינות את תמיסת האנזים כדי להרטיב את החומר. מניחים נייר כסף מעל הכד כדי לחסום את האור. חזור על תהליך זה עד שכל החבילה נחתכת קרוב לתפס הקלסר.
לאחר החיתוך, הפתרון צריך להיראות כך. מעבירים את תמיסת האנזים לצנצנת פעמון. יש לחדור לוואקום במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
דוגרים על שייקר שולחני ב-40 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעתיים וחצי. לאחר הדגירה, לתת את הפתרון מערבולת. זה צריך להיראות חלבי, המציין עיכול מוצלח.
יש לדגור על השייקר השולחני במהירות 80 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות. מניחים את הכד עם תמיסת אנזים על קרח. עצור את העיכול על ידי הוספת נפח אחד של MMG קר כקרח.
מסננים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לפצל את הפתרון לתוך aliquots של לא יותר מ 10 מיליליטר כל אחד. יוצקים לתוך צינורות זכוכית תחתונה עגולה ומקוררת.
צנטריפוגה את הצינורות ב 100 G במשך ארבע דקות. הסר את supernatant, הקפד לא להפריע את הכדור. השהה מחדש, ולאחר מכן דגימות בריכה לשטיפות הבאות.
לשטוף protoplasts פעמיים עם חמישה מיליליטר של MMG. סובב למטה בכל פעם ב 100 G במשך שלוש דקות. הגלולה צריכה להיות בצבע ירוק צהוב בהיר ויפה.
תוכל להשהות מחדש את הגלולה על ידי ערבול עדין של הצינור. להשהות במיליליטר אחד של MMG, ולדלל aliquot קטן 10 עד 20x לספירה. חשוב להשהות מחדש הרבה לפני aliqouting, כמו protoplasts ישקע במהירות.
לטעון את protoplasts מדולל לתוך hemocytometer. ספרו את הפרוטופלסטים תחת מיקרוסקופ אור. הכנה טובה לא תכיל הרבה לכלוך עודף שצף לאחר הכביסה.
פרוטופלסטים טובים הם עגולים עם פלסטידים גלויים. השתמש בספירת התאים כדי לחשב את המספר הכולל. הכנה זו הניבה קצת יותר מ-10 מיליון פרוטופלסטים.
אנו ממליצים לבדוק כדאיות באמצעות צבע דיאצטט פלואורסצאין. בידודים מוצלחים של פרוטופלסטים מניבים את הכדאיות בין 70% ל-90% מערבבים את הפרוטופלסטים עם הפלסמיד המעניין. דוגמה זו משתמשת במיליון פרוטופלסטים וב-15 מיקרוגרם דנ"א.
דוגרים על קרח במשך 30 דקות. השהה מחדש על ידי הקשה על צד הצינור. הוסף תמיסת PEG כדי להגיע לריכוז סופי של 12%PEG.
מערבבים בעדינות על ידי היפוך מספר פעמים. פרוטופלסטים ותמיסת PEG הם שבירים, אז אל תנערו את הצינור. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
מדללים בחמישה כרכים של תמיסת דגירה, ומערבבים בעדינות בהיפוך. צנטריפוגה את הצינורות ב 100 G במשך ארבע דקות. יש לשטוף פעם אחת עם מאגר דגירה של מיליליטר אחד.
היזהר לא להפריע את הכדור. סובב למטה ב 100 G במשך שלוש דקות. השהיה מחדש במאגר הדגירה לריכוז של 500 עד 1000 תאים למיקרוליטר.
יש לדגור בחושך למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, סובב למטה ב 100 G במשך ארבע דקות. יש לשטוף פעמיים בתמיסת דגירה צוננת.
יש לסובב כלפי מטה בכל פעם במשך שלוש דקות ב-100 G בטמפרטורת החדר. השהה מחדש, ולאחר מכן טען aliquot קטן על hemocytometer לבדיקה הסופית. ראשית, ספור את המספר הכולל של פרוטופלסטים תחת שדה בהיר.
כעת, שימו לב לחלק הפרוטופלסטים שזוהרים תחת UV כדי לאמת טרנספקציה. הפרוטופלסטים מבטאים את כתב ה-GFP שלנו. עכשיו, בואו נקבל כמה מדדים על יעילות הטרנספקציה.
בהכנה זו, השגנו 10 מיליון פרוטופלסטים בסך הכל, מתוכם הדבקנו 1 מיליון. למחרת, התאוששנו 335, 000. מתוכם, היה לנו שיעור טרנספורמציה של 30.3% זה משאיר אותנו עם סך של כ -100, 000 פרוטופלסטים המבטאים GFP.
יעילות ההעברה יכולה להשתנות. כפי שניתן לראות בתרשים, אנו רואים באופן שגרתי יעילות בין 20% ל-50% בקרב תכשירים חוזרים. פרוטוקול זה מאפשר איסוף וטרנספורמציה של מיליוני פרוטופלסטים מזופילים של תירס.
אחד החלקים הטובים ביותר של הפרוטוקול הוא היכולת שלו להתרחב. על ידי שינוי קנה מידה של כמות הנפח כמו גם מספר הפרוטופלסטים המשמשים בטרנספורמציה, אתה יכול להגדיל את הטרנספורמציה שלך ביותר מסדר גודל ממה שהראינו היום. נכון להיום, ניסוי הצינור היחיד הגדול ביותר שלנו התחיל עם 20 מיליון פרוטופלסטים ו-200 מיקרוגרם דנ"א, והסתיים עם 3.1 מיליון פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה למחרת.
פרוטוקול תפוקה גבוהה זה שימושי במיוחד כאשר אתה צריך לבדוק מבני פלסמיד רבים ושונים, אך משתפי פעולה השתמשו בפרוטוקול זה למטרות שאינן דורשות את היכולת להתרחב, כגון תכנון מעגלי גנים סינתטיים ותירס. תודה שצפית בסרטון שלנו. אנחנו מקווים שזה עזר.
