通过PINK1 / Parkin途径介导的线粒体自噬 保护 H9c2心肌细胞免受藏红花素氧化应激

该协议为研究自噬细胞的技术方法提供了参考，并详细描述了整个实验程序。该技术的主要优点是它允许观察自噬通量变化的长度。在开始实验之前，确定有效的感染浓度并采取必要的安全措施。

首先在室温下以179G离心中和的H9C2心肌细胞五分钟。弃去上清液，轻轻吹气将细胞混合在DMEM完全培养基中。将细胞分成九个相等的比例。

将二甲基亚砜添加到对照组。然后，向其余组中添加不同浓度的藏红花素。在96孔板中每孔接种100微升细胞。

孵育24小时后，弃去上清液。然后，用PBS洗涤细胞三次。向每个孔中加入100微升DMEM基础培养基，并在37摄氏度下孵育细胞4小时。

现在，加入 20 微升 MTS 并按照所示再孵育两个小时。最后，测量490纳米处的吸光度并计算细胞活力。要测定 ROS，请用无血清培养基以 1：1000 的比例稀释 DCFH-DA。

从先前接种有H9C2细胞的48孔板中丢弃细胞的上清液。然后，用无血清培养基洗涤细胞两次。向每个孔中加入150微升稀释的DCFH-DA，并在37摄氏度下孵育20分钟。

接下来，用无血清培养基洗涤细胞三次。最后，使用荧光显微镜捕获图像。为了分析线粒体膜电位，将JC-1工作溶液添加到先前培养的细胞中并充分混合。

将它们在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。然后，用JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次。向每个孔中加入完整的培养基，并使用荧光显微镜捕获照片。

在室温下用细胞固定溶液固定细胞30分钟。然后，用PBS清洗一次。向每个孔中加入0.3%Triton-100，并在室温下孵育五分钟。

两次PBS洗涤后，向每个孔中加入TUNEL检测工作溶液，并将细胞在37摄氏度的黑暗中孵育60分钟。添加含有抗荧光淬灭片的DAPI，并如图所示捕获图像。在48孔板的每个孔中用新鲜培养基替换先前培养的细胞中的一半培养基。

添加mCherry GFP-LC3B腺病毒，然后加入聚溴乙烯以提高感染效率。每 24 小时更换一次培养基。同时使用共聚焦显微镜观察荧光蛋白表达以确认感染。

感染后，按照手稿中的说明培养和捕获细胞。首先在室温下用4%多聚甲醛固定先前培养的细胞10分钟，然后加入0.1%Triton-100。接下来，用无动物阻断溶液封闭细胞一小时。

然后，将它们与一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，向细胞中加入荧光二抗，并在黑暗中孵育一小时。最后，在捕获图像之前添加含有抗荧光淬灭片的DAPI。

在本研究中，藏红花素对细胞有显著的增殖作用。而浓度高于200微摩尔抑制H9C2细胞的增殖。过氧化氢处理后细胞活力大大降低。

然而，藏红花素在一定程度上扭转了这种变化。过氧化氢处理后ROS水平的增强在一定程度上被藏红花素逆转。荧光结果也证实了藏红花素的ROS降低。

此外，番红花素的添加恢复了由过氧化氢处理引起的线粒体膜电位塌陷。同样，藏红花素也逆转了细胞凋亡。此外，藏红花素预处理逆转了由于过氧化氢处理诱导的H9C2心肌细胞的自噬流。

藏红花素预处理还减少了过氧化氢处理诱导的帕金线粒体易位。按照这一过程，电子显微镜也可用于直接观察微噬细胞，从而可以更直观地观察线粒体被自噬体吞噬。