Bu protokol, otofaj çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürleri ayrıntılı olarak açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, otofajik akıdaki değişimin uzunluk gözlemine izin vermesidir. Deneye başlamadan önce, etkili enfeksiyon konsantrasyonunu belirleyin ve gerekli güvenlik önlemlerini alın.
Nötralize edilmiş H9C2 miyokard hücrelerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 179G'de santrifüj ederek başlayın. Süpernatantı atın ve hücreleri DMEM komple ortamında hafifçe üfleyerek karıştırın. Hücreleri dokuz eşit orana bölün.
Kontrol grubuna dimetil sülfoksit ekleyin. Ardından, kalan gruplara değişen konsantrasyonlarda krosetin ekleyin. 96 delikli bir plakada kuyu başına 100 mikrolitre hücre tohumlayın.
24 saat boyunca inkübe edildikten sonra, süpernatanı atın. Ardından, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa 100 mikrolitre DMEM bazal ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.
Şimdi, 20 mikrolitre MTS ekleyin ve gösterildiği gibi iki saat daha inkübe edin. Son olarak, absorbansı 490 nanometrede ölçün ve hücre canlılığını hesaplayın. ROS'u belirlemek için, DCFH-DA'yı serumsuz ortam ile 1:1000 oranında seyreltin.
Hücrenin süpernatantını, daha önce H9C2 hücreleri ile tohumlanmış 48 delikli bir plakadan atın. Ardından, hücreleri serumsuz bir ortamla iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 150 mikrolitre seyreltilmiş DCFH-DA ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri serumsuz ortamla üç kez yıkayın. Son olarak, floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri yakalayın. Mitokondriyal membran potansiyelini analiz etmek için, daha önce kültürlenmiş hücrelere JC-1 çalışma çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
Onları 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, hücreleri JC-1 boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa tam bir ortam ekleyin ve floresan mikroskobu kullanarak fotoğraf çekin.
Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücre fiksasyon çözeltisi ile sabitleyin. Ardından, bir kez PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa% 0.3 Triton-100 ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.
İki PBS yıkamasından sonra, her bir kuyucuğa TUNEL algılama çalışma solüsyonu ekleyin ve hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir anti-floresan söndürme tableti içeren DAPI ekleyin ve görüntüleri gösterildiği gibi yakalayın. Daha önce kültürlenmiş hücrelerden gelen ortamın yarısını, 48 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda taze ortamla değiştirin.
Enfeksiyon verimliliğini artırmak için mCherry GFP-LC3B adenovirüsünü ve ardından polibreni ekleyin. Ortamı her 24 saatte bir değiştirin. Aynı anda bir konfokal mikroskop kullanarak, enfeksiyonu doğrulamak için floresan protein ekspresyonunu gözlemleyin.
Enfekte olduktan sonra, el yazmasında açıklandığı gibi hücreleri kültürleyin ve yakalayın. Daha önce kültürlenmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyerek başlayın ve% 0.1 Triton-100 ekleyin. Daha sonra, hücreleri bir saat boyunca hayvansız bir blok çözeltisi ile bloke edin.
Daha sonra, onları bir gecede dört santigrat derecede birincil bir antikor ile inkübe edin. Ertesi gün, hücrelere floresan ikincil bir antikor ekleyin ve bir saat boyunca karanlıkta inkübe edin. Son olarak, görüntüleri yakalamadan önce anti-floresan söndürme tabletleri içeren DAPI'yi ekleyin.
Bu çalışmada, krosetinin hücreler üzerinde anlamlı bir proliferatif etkisi vardı. 200 mikromolar'ın üzerindeki bir konsantrasyon H9C2 hücrelerinin çoğalmasını inhibe ederken. Hidrojen peroksit tedavisinden sonra hücre canlılığı önemli ölçüde azaldı.
Bununla birlikte, krosetin bu değişikliği bir dereceye kadar tersine çevirdi. Hidrojen peroksit işleminden sonra artan ROS seviyesi, krosetin tarafından bir dereceye kadar tersine çevrildi. Floresan sonuçları ayrıca krosetin ile ROS'un azaldığını doğruladı.
Ayrıca, krosetin ilavesi, hidrojen peroksit işleminin neden olduğu mitokondriyal membran potansiyel çökmelerini geri yükledi. Benzer şekilde, apoptoz da krosetin tarafından tersine çevrildi. Ek olarak, krosetin ön tedavisi, hidrojen peroksit tedavisi nedeniyle indüklenen H9C2 kardiyomiyositlerinin otofaji akışını tersine çevirdi.
Krosetin ön işlemi, hidrojen peroksit muamelesi ile indüklenen Parkin mitokondrisinin translokasyonunu da azalttı. Bu prosedürü takiben, elektron mikroskobik ayrıca bir mikrofajı doğrudan gözlemlemek için de kullanılabilir, bu da otofagozomlar tarafından yutulan mitokondrinin daha sezgisel bir görünümünü sağlar.
