이 프로토콜은 자가파지 연구에 대한 기술 접근법에 대한 참조를 제공하고 전체 실험 절차를 자세히 설명합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 자가포식 플럭스의 변화를 길이 관찰할 수 있다는 것입니다. 실험을 시작하기 전에 효과적인 감염 농도를 결정하고 필요한 안전 조치를 취하십시오.
중화된 H9C2 심근 세포를 실온에서 5분 동안 179G에서 원심분리하는 것으로 시작한다. 상층액을 버리고 DMEM 완전 배지에서 세포를 부드럽게 불어넣어 혼합한다. 세포를 9 개의 동일한 비율로 나눕니다.
디메틸 설폭사이드를 대조군에 추가합니다. 그런 다음 나머지 그룹에 다양한 농도의 크로세틴을 추가합니다. 96-웰 플레이트에서 웰 당 100 마이크로리터의 세포를 시딩한다.
24시간 동안 배양한 후에는 상층액을 버립니다. 그 후, 세포를 PBS로 3회 세척한다. 100 마이크로리터의 DMEM 기본 배지를 각 웰에 첨가하고 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양한다.
이제 20마이크로리터의 MTS를 추가하고 그림과 같이 2시간 더 배양합니다. 마지막으로 490나노미터에서 흡광도를 측정하고 세포 생존율을 계산합니다. ROS를 측정하려면 DCFH-DA를 무혈청 배지와 1:1000 비율로 희석합니다.
이전에 H9C2 세포로 시드된 48웰 플레이트에서 세포의 상청액을 버립니다. 그런 다음 무혈청 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 희석된 DCFH-DA 150마이크로리터를 각 웰에 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
다음으로, 무혈청 배지로 세포를 3회 세척한다. 마지막으로 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 미토콘드리아 막 전위를 분석하려면 이전에 배양된 세포에 JC-1 작업 용액을 추가하고 잘 혼합합니다.
섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 그 후, JC-1 염색 완충액으로 세포를 2회 세척한다. 각 웰에 완전한 배지를 추가하고 형광 현미경을 사용하여 사진을 캡처합니다.
세포 고정 용액으로 세포를 실온에서 30분 동안 고정한다. 그런 다음 PBS로 한 번 씻으십시오. 각 웰에 0.3%Triton-100을 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
PBS 세척 2회 후 TUNEL 검출 작업 용액을 각 웰에 넣고 암실 속에서 섭씨 37도에서 60분 동안 세포를 배양합니다. 형광 소광 정제가 포함된 DAPI를 추가하고 그림과 같이 이미지를 캡처합니다. 이전에 배양된 세포의 배지 절반을 48웰 플레이트의 각 웰에서 신선한 배지로 교체합니다.
mCherry GFP-LC3B 아데노바이러스와 폴리브렌을 첨가하여 감염 효율을 개선합니다. 24시간마다 매체를 교체하십시오. 동시에 컨포칼 현미경을 사용하여 형광 단백질 발현을 관찰하여 감염을 확인합니다.
일단 감염되면 원고에 설명된 대로 세포를 배양하고 포획합니다. 이전에 배양된 세포를 실온에서 4분 동안 10% 파라포름알데히드로 고정하고 0.1% Triton-100을 첨가하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 동물성 없는 블록 용액으로 세포를 1시간 동안 차단한다.
그런 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1차 항체와 함께 배양합니다. 다음날, 형광 2차 항체를 세포에 첨가하고 어둠 속에서 1시간 동안 배양한다. 마지막으로 이미지를 캡처하기 전에 형광 소멸 방지 정제가 포함된 DAPI를 추가합니다.
본 연구에서, 크로세틴은 세포에 상당한 증식 효과를 나타냈다. 200 마이크로몰 이상의 농도는 H9C2 세포의 증식을 억제하였다. 세포 생존율은 과산화수소 처리 후 상당히 감소하였다.
그러나 크로세틴은 이러한 변화를 어느 정도 역전시켰습니다. 과산화수소 처리 후 향상된 ROS 수준은 크로세틴에 의해 어느 정도 역전되었습니다. 형광 결과는 또한 크로세틴으로 감소된 ROS를 확인했습니다.
또한, 크로세틴 또한 과산화수소 처리로 인한 미토콘드리아 막 붕괴 전위를 회복시켰다. 유사하게, 세포 사멸도 크로세틴에 의해 역전되었다. 또한, 크로세틴 전처리는 과산화수소 처리로 인해 유도된 H9C2 심근세포의 자가포식 흐름을 역전시켰다.
크로세틴 전처리는 또한 과산화수소 처리에 의해 유도된 파킨 미토콘드리아의 전좌를 감소시켰다. 이 절차에 따라 전자 현미경을 사용하여 마이크로파지를 직접 관찰할 수도 있으므로 자가포식소체에 의해 삼켜지는 미토콘드리아를 보다 직관적으로 볼 수 있습니다.
