Dieses Protokoll bietet eine Referenz für den technischen Ansatz zur Untersuchung von Autophagen und beschreibt die gesamten experimentellen Abläufe im Detail. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Längenbeobachtung der Änderung des autophagischen Flusses ermöglicht. Bestimmen Sie vor Beginn des Experiments die effektive Infektionskonzentration und ergreifen Sie die erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen.
Beginnen Sie mit der Zentrifugation neutralisierter H9C2-Myokardzellen bei 179 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie die Zellen durch leichtes Blasen in DMEM-Komplettmedium. Teilen Sie die Zellen in neun gleiche Proportionen.
Fügen Sie der Kontrollgruppe Dimethylsulfoxid hinzu. Fügen Sie dann den verbleibenden Gruppen unterschiedliche Konzentrationen von Crocetin hinzu. Säen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte.
Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird der Überstand entsorgt. Waschen Sie die Zellen dann dreimal mit PBS. Geben Sie 100 Mikroliter DMEM-Basalmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Fügen Sie nun 20 Mikroliter MTS hinzu und inkubieren Sie weitere zwei Stunden wie gezeigt. Messen Sie schließlich die Absorption bei 490 Nanometern und berechnen Sie die Zellviabilität. Um die ROS zu bestimmen, wird DCFH-DA im Verhältnis 1:1000 mit dem serumfreien Medium verdünnt.
Verwerfen Sie den Überstand der Zelle von einer 48-Well-Platte, die zuvor mit H9C2-Zellen besiedelt wurde. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit einem serumfreien Medium. In jede Vertiefung werden 150 Mikroliter verdünntes DCFH-DA gegeben und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit serumfreiem Medium. Nehmen Sie schließlich Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Um das Potenzial der mitochondrialen Membran zu analysieren, fügen Sie den zuvor kultivierten Zellen JC-1-Arbeitslösung hinzu und mischen Sie sie gut.
Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit JC-1 Färbepuffer. Fügen Sie jedem Well ein komplettes Medium hinzu und nehmen Sie Fotos mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.
Fixieren Sie die Zellen mit Zellfixierlösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie sie dann einmal mit PBS. Geben Sie 0,3 % Triton-100 in jede Vertiefung und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Geben Sie nach zwei PBS-Waschungen die TUNEL-Detektionsarbeitslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Fügen Sie DAPI hinzu, das eine Anti-Fluoreszenz-Löschtablette enthält, und nehmen Sie die Bilder wie gezeigt auf. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums aus den zuvor kultivierten Zellen durch frisches Medium in jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte.
Fügen Sie das mCherry GFP-LC3B-Adenovirus gefolgt von Polybren hinzu, um die Infektionseffizienz zu verbessern. Tauschen Sie das Medium alle 24 Stunden aus. Beobachten Sie gleichzeitig mit einem konfokalen Mikroskop die fluoreszierende Proteinexpression, um die Infektion zu bestätigen.
Nach der Infektion kultivieren und fangen Sie die Zellen wie im Manuskript beschrieben ein. Beginnen Sie mit der Fixierung zuvor kultivierter Zellen mit 4%Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und fügen Sie 0,1%Triton-100 hinzu. Als nächstes blockieren Sie die Zellen für eine Stunde mit einer tierfreien Blocklösung.
Inkubieren Sie sie dann über Nacht mit einem Primärantikörper bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie einen fluoreszierenden Sekundärantikörper in die Zellen und inkubieren sie eine Stunde lang im Dunkeln. Fügen Sie schließlich die DAPI hinzu, die Anti-Fluoreszenz-Löschtabletten enthält, bevor Sie die Bilder aufnehmen.
In der vorliegenden Studie hatte Crocetin eine signifikante proliferative Wirkung auf die Zellen. Eine Konzentration von über 200 Mikromolar hemmte die Proliferation von H9C2-Zellen. Die Zellviabilität war nach der Wasserstoffperoxid-Behandlung deutlich reduziert.
Crocetin machte diese Veränderung jedoch bis zu einem gewissen Grad rückgängig. Der erhöhte ROS-Spiegel nach der Wasserstoffperoxidbehandlung wurde durch Crocetin bis zu einem gewissen Grad rückgängig gemacht. Die Fluoreszenzergebnisse bestätigten auch eine reduzierte ROS mit Crocetin.
Darüber hinaus stellte Crocetin zusätzlich die kollabierenden Mitochondrienmembran-Potentialkollapse wieder her, die durch die Wasserstoffperoxid-Behandlung verursacht wurden. In ähnlicher Weise wurde die Apoptose auch durch Crocetin rückgängig gemacht. Darüber hinaus kehrte die Crocetin-Vorbehandlung den Autophagiefluss von H9C2-Kardiomyozyten um, der durch die Wasserstoffperoxid-Behandlung induziert wurde.
Die Crocetin-Vorbehandlung reduzierte auch die Translokation von Parkin-Mitochondrien, die durch die Wasserstoffperoxid-Behandlung induziert wurde. Nach diesem Verfahren kann die Elektronenmikroskopie auch zur direkten Beobachtung eines Mikrophagen verwendet werden, was eine intuitivere Sicht auf Mitochondrien ermöglicht, die von Autophagosomen verschlungen werden.
