Este protocolo proporciona una referencia para el enfoque técnico para el estudio de autófagos y describe todos los procedimientos experimentales en detalle. La principal ventaja de esta técnica es que permite la observación de la longitud del cambio en el flujo autofágico. Antes de comenzar el experimento, determine la concentración efectiva de infección y tome las medidas de seguridad necesarias.
Comience centrifugando células miocárdicas H9C2 neutralizadas a 179 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y mezcle las células en el medio completo DMEM soplando suavemente. Divide las celdas en nueve proporciones iguales.
Agregue dimetilsulfóxido al grupo de control. Luego, agregue concentraciones variables de crocetina a los grupos restantes. Sembrar 100 microlitros de células por pocillo en una placa de 96 pocillos.
Una vez incubado durante 24 horas, desechar el sobrenadante. Luego, lave las celdas tres veces con PBS. Agregue 100 microlitros de medio basal DMEM a cada pocillo e incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados.
Ahora, agregue 20 microlitros de MTS e incube durante otras dos horas como se demostró. Finalmente, medir la absorbancia a 490 nanómetros y calcular la viabilidad celular. Para determinar ROS, diluir DCFH-DA en una proporción de 1:1000 con el medio libre de suero.
Deseche el sobrenadante de la célula de una placa de 48 pocillos, previamente sembrada con células H9C2. Luego, lave las células dos veces con un medio sin suero. Agregue 150 microlitros de DCFH-DA diluido a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, lave las células tres veces con un medio sin suero. Finalmente, capture imágenes usando un microscopio de fluorescencia. Para analizar el potencial de la membrana mitocondrial, agregue la solución de trabajo JC-1 a las células previamente cultivadas y mezcle bien.
Incubarlos a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Luego, lave las células dos veces con tampón de tinción JC-1. Agregue un medio completo a cada pocillo y capture fotografías con un microscopio de fluorescencia.
Fijar las células con solución de fijación celular durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lávelos con PBS una vez. Agregue 0.3% Triton-100 a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Después de dos lavados PBS, agregue la solución de trabajo de detección TUNEL a cada pocillo e incube las células a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 60 minutos. Agregue DAPI que contenga una tableta de enfriamiento antifluorescencia y capture las imágenes como se demuestra. Reemplace la mitad del medio de las células previamente cultivadas con medio fresco en cada pocillo de una placa de 48 pocillos.
Agregue el adenovirus mCherry GFP-LC3B seguido de porodeno para mejorar la eficiencia de la infección. Reemplace el medio cada 24 horas. Simultáneamente, utilizando un microscopio confocal, observe la expresión de proteínas fluorescentes para confirmar la infección.
Una vez infectado, cultive y capture las células como se describe en el manuscrito. Comience fijando las células previamente cultivadas con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y agregue 0.1% Triton-100. A continuación, bloquee las células con una solución de bloque libre de animales durante una hora.
Luego, incubarlos con un anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue un anticuerpo secundario fluorescente a las células e incubarlas en la oscuridad durante una hora. Finalmente, agregue el DAPI que contiene tabletas de enfriamiento antifluorescencia antes de capturar las imágenes.
En el presente estudio, la crocetina tuvo un efecto proliferativo significativo en las células. Mientras que una concentración por encima de 200 micromolares inhibió la proliferación de células H9C2. La viabilidad celular se redujo considerablemente después del tratamiento con peróxido de hidrógeno.
Sin embargo, la crocetina revirtió este cambio hasta cierto punto. El nivel mejorado de ROS después del tratamiento con peróxido de hidrógeno fue revertido por la crocetina hasta cierto punto. Los resultados de fluorescencia también confirmaron una reducción de ROS con crocetina.
Además, la crocetina además restauró los colapsos potenciales de la membrana mitocondrial causados por el tratamiento con peróxido de hidrógeno. Del mismo modo, la apoptosis también fue revertida por la crocetina. Además, el pretratamiento con crocetina revirtió el flujo de autofagia de los cardiomiocitos H9C2, inducido debido al tratamiento con peróxido de hidrógeno.
El pretratamiento con crocetina también redujo la translocación de las mitocondrias Parkin inducida por el tratamiento con peróxido de hidrógeno. Después de este procedimiento, el microscópico electrónico también se puede usar para observar directamente un microfago, lo que permite una visión más intuitiva de las mitocondrias que están siendo engullidas por autofagosomas.
