פרוטוקול זה מספק התייחסות לגישת הטכניקה לחקר אוטופאגים והוא מתאר בפירוט את כל הליכי הניסוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תצפית אורך של השינוי בשטף אוטופגי. לפני תחילת הניסוי, לקבוע את ריכוז הזיהום היעיל ונקיטת אמצעי הבטיחות הדרושים.
התחילו בצנטריפוגה של תאי שריר הלב H9C2 מנוטרלים במשקל 179G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט וערבבו את התאים במדיום המלא של DMEM על ידי נשיפה עדינה. חלק את התאים לתשעה פרופורציות שוות.
הוסף dimethyl sulfoxide לקבוצת הביקורת. לאחר מכן, להוסיף ריכוזים משתנים של crocetin לקבוצות הנותרות. זרע 100 מיקרוליטר של תאים לכל באר בצלחת 96 באר.
לאחר הדגירה במשך 24 שעות, להשליך את supernatant. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי DMEM לכל באר ודגר על התאים במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
עכשיו, להוסיף 20 מיקרוליטר של MTS ולדגור עוד שעתיים כפי שהודגם. לבסוף, למדוד את הספיגה ב 490 ננומטר ולחשב את כדאיות התא. כדי לקבוע ROS, יש לדלל DCFH-DA ביחס של 1:1000 עם התווך נטול הסרום.
השליכו את הסופרנאטנט של התא מצלחת בת 48 בארות, שנזרעה בעבר עם תאי H9C2. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם מדיום ללא סרום. מוסיפים 150 מיקרוליטר DCFH-DA מדולל לכל באר ודגרים עליה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיום ללא סרום. לבסוף, צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לנתח את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, הוסיפו תמיסת עבודה JC-1 לתאים שגודלו בעבר בתרבית וערבבו היטב.
לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם חיץ צביעה JC-1. הוסף מדיום שלם לכל באר וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תקן את התאים עם תמיסת קיבוע תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף אותם עם PBS פעם אחת. מוסיפים 0.3% טריטון-100 לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר שתי שטיפות PBS, הוסף פתרון עבודה לזיהוי TUNEL לכל באר ודגר על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 60 דקות. הוסף DAPI המכיל לוח מרווה נגד פלואורסצנטיות וצלם את התמונות כפי שהודגם . החלף מחצית מהמדיום מהתאים שגודלו בעבר בתרבית בתווך טרי בכל באר של צלחת בת 48 בארות.
הוסף את mCherry GFP-LC3B אדנווירוס ואחריו פוליברן כדי לשפר את יעילות הזיהום. החלף את המדיום כל 24 שעות. בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, לצפות ביטוי חלבון פלואורסצנטי כדי לאשר זיהום.
לאחר ההדבקה, תרבית ותלכוד את התאים כמתואר בכתב היד. התחל על ידי תיקון תאים בתרבית בעבר עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהוסיף 0.1% Triton-100. לאחר מכן, חסום את התאים עם פתרון בלוק ללא בעלי חיים למשך שעה אחת.
לאחר מכן, לדגור אותם עם נוגדן ראשוני בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה. למחרת, הוסיפו נוגדן משני פלואורסצנטי לתאים ודגרו עליהם בחושך למשך שעה. לבסוף, הוסף את DAPI המכיל טבליות מרווה נגד פלואורסצנטיות לפני לכידת התמונות.
במחקר הנוכחי, לקרוצטין הייתה השפעה משמעותית על התאים. בעוד ריכוז מעל 200 מיקרומולר עיכב את התפשטות תאי H9C2. כדאיות התא הופחתה במידה ניכרת לאחר טיפול במי חמצן.
עם זאת, קרוצטין הפך את השינוי הזה במידה מסוימת. רמת ה- ROS המשופרת לאחר טיפול במי חמצן התהפכה במידה מסוימת על ידי קרוצטין. תוצאות הפלואורסצנטיות אישרו גם ירידה ב- ROS עם קרוצטין.
יתר על כן, תוספת קרוצטין שיקמה את הקריסה הפוטנציאלית של הממברנה המיטוכונדריאלית שנגרמה על ידי טיפול במי חמצן. באופן דומה, אפופטוזיס היה גם הפוך על ידי crocetin. בנוסף, הטיפול המקדים של קרוצטין הפך את זרימת האוטופגיה של קרדיומיוציטים H9C2, המושרה עקב טיפול במי חמצן.
טיפול מקדים של קרוצטין גם הפחית את הטרנסלוקציה של מיטוכונדריה פרקין הנגרמת על ידי טיפול במי חמצן. בעקבות הליך זה, מיקרוסקופי אלקטרונים יכול לשמש גם כדי לצפות ישירות במיקרופג, מה שמאפשר מבט אינטואיטיבי יותר על מיטוכונדריה שנבלעים על ידי אוטופגוזומים.
