Ce protocole fournit une référence pour l’approche technique de l’étude des autophages et décrit en détail l’ensemble des procédures expérimentales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’observation en longueur du changement de flux autophagique. Avant de commencer l’expérience, déterminez la concentration effective de l’infection et prenez les mesures de sécurité nécessaires.
Commencez par centrifuger les cellules myocardiques H9C2 neutralisées à 179G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et mélanger les cellules dans le milieu complet DMEM en soufflant doucement. Divisez les cellules en neuf proportions égales.
Ajouter le sulfoxyde de diméthyle au groupe témoin. Ensuite, ajoutez des concentrations variables de crocétine aux groupes restants. Ensemencez 100 microlitres de cellules par puits dans une plaque de 96 puits.
Une fois incubé pendant 24 heures, jetez le surnageant. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ajouter 100 microlitres de milieu basal DMEM à chaque puits et incuber les cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.
Maintenant, ajoutez 20 microlitres de MTS et incuber pendant deux heures supplémentaires comme démontré. Enfin, mesurez l’absorbance à 490 nanomètres et calculez la viabilité cellulaire. Pour déterminer les ROS, diluer le DCFH-DA dans un rapport de 1:1000 avec le milieu sans sérum.
Jetez le surnageant de la cellule d’une plaque de 48 puits, préalablement ensemencée avec des cellules H9C2. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un milieu sans sérum. Ajoutez 150 microlitres de DCFH-DA dilué à chaque puits et incuberez-le à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, lavez les cellules trois fois avec un milieu sans sérum. Enfin, capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence. Pour analyser le potentiel de la membrane mitochondriale, ajoutez la solution de travail JC-1 aux cellules précédemment cultivées et mélangez bien.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un tampon de coloration JC-1. Ajoutez un support complet à chaque puits et capturez des photographies à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Fixez les cellules avec une solution de fixation cellulaire pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez-les avec PBS une fois. Ajouter 0,3% Triton-100 à chaque puits et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Après deux lavages PBS, ajoutez la solution de détection TUNEL à chaque puits et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 60 minutes. Ajoutez un DAPI contenant un comprimé de trempe anti-fluorescence et capturez les images comme démontré. Remplacer la moitié du milieu des cellules précédemment cultivées par un milieu frais dans chaque puits d’une plaque de 48 puits.
Ajouter l’adénovirus mCherry GFP-LC3B suivi de polybrène pour améliorer l’efficacité de l’infection. Remplacez le milieu toutes les 24 heures. À l’aide simultanée d’un microscope confocal, observer l’expression des protéines fluorescentes pour confirmer l’infection.
Une fois infectées, cultivez et capturez les cellules comme décrit dans le manuscrit. Commencez par fixer les cellules préalablement cultivées avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et ajoutez 0,1% Triton-100. Ensuite, bloquez les cellules avec une solution de bloc sans animaux pendant une heure.
Ensuite, incuber avec un anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez un anticorps secondaire fluorescent aux cellules et incuberez-les dans l’obscurité pendant une heure. Enfin, ajoutez le DAPI contenant des comprimés de trempe anti-fluorescence avant de capturer les images.
Dans la présente étude, la crocétine a eu un effet prolifératif significatif sur les cellules. Alors qu’une concentration supérieure à 200 micromolaires inhibait la prolifération des cellules H9C2. La viabilité cellulaire a été considérablement réduite après un traitement au peroxyde d’hydrogène.
Cependant, la crocétine a inversé ce changement dans une certaine mesure. Le niveau accru de ROS après traitement au peroxyde d’hydrogène a été inversé par la crocétine dans une certaine mesure. Les résultats de fluorescence ont également confirmé une réduction des ROS avec la crocétine.
En outre, l’ajout de crocétine a restauré les effondrements potentiels de la membrane mitochondriale causés par le traitement au peroxyde d’hydrogène. De même, l’apoptose a également été inversée par la crocétine. De plus, le prétraitement à la crocétine a inversé le flux d’autophagie des cardiomyocytes H9C2, induit par le traitement au peroxyde d’hydrogène.
Le prétraitement à la crocétine a également réduit la translocation des mitochondries Parkin induite par le traitement au peroxyde d’hydrogène. Suite à cette procédure, le microscopie électronique peut également être utilisé pour observer directement un microphage, permettant une vue plus intuitive des mitochondries englouties par les autophagosomes.
