يوفر هذا البروتوكول مرجعا لنهج التقنية لدراسة autophage ويصف الإجراءات التجريبية بأكملها بالتفصيل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بمراقبة طول التغيير في تدفق الالتهام الذاتي. قبل البدء في التجربة ، حدد تركيز العدوى الفعال واتخاذ تدابير السلامة اللازمة.
ابدأ بالطرد المركزي لخلايا عضلة القلب H9C2 المحايدة عند 179 جيجا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية واخلط الخلايا في وسط DMEM الكامل عن طريق النفخ برفق. قسم الخلايا إلى تسع نسب متساوية.
أضف ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى المجموعة الضابطة. ثم أضف تركيزات متفاوتة من الكروسيتين إلى المجموعات المتبقية. بذر 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في صفيحة 96 بئرا.
بمجرد حضنها لمدة 24 ساعة ، تخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي DMEM إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية.
الآن ، أضف 20 ميكرولترا من MTS واحتضانها لمدة ساعتين أخريين كما هو موضح. أخيرا ، قم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر واحسب صلاحية الخلية. لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية ، قم بتخفيف DCFH-DA بنسبة 1: 1000 باستخدام الوسط الخالي من المصل.
تخلص من طاف الخلية من صفيحة 48 بئرا ، تم زرعها مسبقا بخلايا H9C2. ثم اغسل الخلايا مرتين بوسط خال من المصل. أضف 150 ميكرولترا من DCFH-DA المخفف إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بوسط خال من المصل. أخيرا ، التقط الصور باستخدام مجهر مضان. لتحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، أضف محلول عمل JC-1 إلى الخلايا المزروعة مسبقا واخلطها جيدا.
احتضانهم عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتلطيخ JC-1. أضف وسيطا كاملا لكل بئر والتقط صورا باستخدام مجهر مضان.
إصلاح الخلايا بمحلول تثبيت الخلية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسلها ببرنامج تلفزيوني مرة واحدة. أضف 0.3٪ Triton-100 إلى كل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
بعد غسلتين من PBS ، أضف حل عمل الكشف TUNEL إلى كل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 60 دقيقة. أضف DAPI الذي يحتوي على قرص تبريد مضاد للتألق والتقط الصور كما هو موضح. استبدل نصف الوسط من الخلايا المزروعة سابقا بوسط جديد في كل بئر من صفيحة 48 بئرا.
أضف الفيروس الغدي mCherry GFP-LC3B متبوعا بالبوليبرين لتحسين كفاءة العدوى. استبدل الوسيلة كل 24 ساعة. في وقت واحد باستخدام المجهر متحد البؤر ، لاحظ تعبير البروتين الفلوري لتأكيد العدوى.
بمجرد الإصابة ، قم بزراعة الخلايا والتقاطها كما هو موضح في المخطوطة. ابدأ بتثبيت الخلايا المزروعة مسبقا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأضف 0.1٪ Triton-100. بعد ذلك ، قم بحظر الخلايا بمحلول كتلة خال من الحيوانات لمدة ساعة واحدة.
ثم احتضنهم بجسم مضاد أولي عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف جسما مضادا ثانويا فلوريا إلى الخلايا واحتضانها في الظلام لمدة ساعة واحدة. أخيرا ، أضف DAPI الذي يحتوي على أقراص تبريد مضادة للتألق قبل التقاط الصور.
في هذه الدراسة ، كان للكروسيتين تأثير تكاثري كبير على الخلايا. في حين أن التركيز فوق 200 ميكرومولار يمنع تكاثر خلايا H9C2. تم تقليل صلاحية الخلية بشكل كبير بعد معالجة بيروكسيد الهيدروجين.
ومع ذلك ، عكس الكروسيتين هذا التغيير إلى حد ما. تم عكس مستوى ROS المعزز بعد معالجة بيروكسيد الهيدروجين بواسطة الكروسيتين إلى حد ما. أكدت نتائج مضان أيضا انخفاض أنواع الأكسجين التفاعلية مع الكروسيتين.
علاوة على ذلك ، أعادت إضافة الكروسيتين الانهيارات المحتملة لغشاء الميتوكوندريا الناتجة عن معالجة بيروكسيد الهيدروجين. وبالمثل ، تم عكس موت الخلايا المبرمج أيضا بواسطة الكروسيتين. بالإضافة إلى ذلك ، عكست المعالجة المسبقة للكروسيتين تدفق الالتهام الذاتي لخلايا عضلة القلب H9C2 ، الناجمة عن علاج بيروكسيد الهيدروجين.
كما قللت المعالجة المسبقة للكروسيتين من انتقال ميتوكوندريا باركين الناجم عن معالجة بيروكسيد الهيدروجين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا استخدام المجهر الإلكتروني لمراقبة المجهرية مباشرة ، مما يسمح برؤية أكثر سهولة للميتوكوندريا التي تبتلعها البلعمة الذاتية.
