Este protocolo fornece uma referência para a abordagem técnica para o estudo de autófagos e descreve detalhadamente todos os procedimentos experimentais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a observação do comprimento da mudança no fluxo autofágico. Antes de iniciar o experimento, determine a concentração de infecção efetiva e tome as medidas de segurança necessárias.
Comece centrifugando células miocárdicas H9C2 neutralizadas a 179G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e misture as células em meio completo DMEM soprando suavemente. Divida as células em nove proporções iguais.
Adicionar dimetilsulfóxido ao grupo controle. Em seguida, adicione concentrações variáveis de crocetina aos grupos restantes. Seme 100 microlitros de células por poço em uma placa de 96 poços.
Uma vez incubado por 24 horas, descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as células três vezes com PBS. Adicione 100 microlitros de meio basal DMEM a cada poço e incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius.
Agora, adicione 20 microlitros de MTS e incube por mais duas horas, como demonstrado. Finalmente, meça a absorbância a 490 nanômetros e calcule a viabilidade celular. Para determinar as EROs, diluir a DCFH-DA na proporção de 1:1000 com o meio sem soro.
Descarte o sobrenadante da célula de uma placa de 48 poços, previamente semeada com células H9C2. Em seguida, lave as células duas vezes com um meio sem soro. Adicione 150 microlitros de DCFH-DA diluído a cada poço e incube-o a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, lave as células três vezes com meio sem soro. Finalmente, capturar imagens usando um microscópio de fluorescência. Para analisar o potencial de membrana mitocondrial, adicione a solução de trabalho JC-1 às células previamente cultivadas e misture bem.
Incube-os a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, lave as células duas vezes com tampão corante JC-1. Adicione meio completo a cada poço e capture fotografias usando um microscópio de fluorescência.
Fixar as células com solução de fixação celular durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave-os com PBS uma vez. Adicionar 0,3% de Triton-100 a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante cinco minutos.
Após duas lavagens de PBS, adicione a solução de trabalho de detecção TUNEL a cada poço e incube as células a 37 graus Celsius no escuro por 60 minutos. Adicione DAPI contendo um comprimido de têmpera antifluorescência e capture as imagens conforme demonstrado. Substitua metade do meio das células previamente cultivadas por meio fresco em cada poço de uma placa de 48 poços.
Adicione o adenovírus mCherry GFP-LC3B seguido de polibreno para melhorar a eficiência da infecção. Substitua o meio a cada 24 horas. Simultaneamente, usando um microscópio confocal, observar a expressão de proteínas fluorescentes para confirmar a infecção.
Uma vez infectadas, cultivar e capturar as células conforme descrito no manuscrito. Comece fixando células previamente cultivadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente e adicione 0,1% de Triton-100. Em seguida, bloqueie as células com uma solução de bloco livre de animais por uma hora.
Em seguida, incube-os com um anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione um anticorpo secundário fluorescente às células e incube-as no escuro por uma hora. Finalmente, adicione o DAPI contendo comprimidos de têmpera antifluorescência antes de capturar as imagens.
No presente estudo, a crocetina teve um efeito proliferativo significativo sobre as células. Enquanto uma concentração acima de 200 micromolares inibiu a proliferação de células H9C2. A viabilidade celular foi reduzida consideravelmente após o tratamento com peróxido de hidrogênio.
No entanto, a crocetina reverteu essa mudança até certo ponto. O aumento do nível de ROS após o tratamento com peróxido de hidrogênio foi revertido pela crocetina até certo ponto. Os resultados de fluorescência também confirmaram a redução das ERO com crocetina.
Além disso, a adição de crocetina restaurou os colapsos potenciais de membrana mitocondrial causados pelo tratamento com peróxido de hidrogênio. Da mesma forma, a apoptose também foi revertida pela crocetina. Além disso, o pré-tratamento com crocetina reverteu o fluxo de autofagia dos cardiomiócitos H9C2, induzido pelo tratamento com peróxido de hidrogênio.
O pré-tratamento com crocetina também reduziu a translocação de mitocôndrias de Parkin induzida pelo tratamento com peróxido de hidrogênio. Após esse procedimento, a microscopia eletrônica também pode ser usada para observar diretamente um micrófago, permitindo uma visão mais intuitiva das mitocôndrias sendo engolidas por autofagossomos.
