このプロトコルは、オートファージの研究への技術アプローチのリファレンスを提供し、実験手順全体を詳細に説明しています。この技術の主な利点は、オートファジーフラックスの変化の長さ観察を可能にすることである。実験を開始する前に、有効な感染濃度を決定し、必要な安全対策を講じてください。
中和H9C2心筋細胞を179Gで室温で5分間遠心分離することから始めます。上清を捨て、穏やかに吹き付けることによりDMEM完全培地中の細胞を混合する。セルを9つの等しい比率に分割します。
対照群にジメチルスルホキシドを加える。次に、残りのグループにさまざまな濃度のクロセチンを追加します。ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートに播種します。
24時間インキュベートしたら、上清を捨てる。その後、細胞をPBSで3回洗浄する。各ウェルに100マイクロリットルのDMEM基礎培地を加え、細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。
次に、20マイクロリットルのMTSを追加し、示されているようにさらに2時間インキュベートします。最後に、490ナノメートルの吸光度を測定し、細胞生存率を計算します。ROSを測定するには、DCFH-DAを無血清培地で1:1000の比率で希釈します。
H9C2細胞を予め播種した48ウェルプレートから細胞の上清を廃棄します。その後、無血清培地で細胞を2回洗浄する。150マイクロリットルの希釈DCFH-DAを各ウェルに加え、摂氏37度で20分間インキュベートします。
次に、無血清培地で細胞を3回洗浄する。最後に、蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。ミトコンドリア膜電位を分析するには、以前に培養した細胞にJC-1作業溶液を添加し、よく混合します。
摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、細胞をJC-1染色バッファーで2回洗浄する。各ウェルに完全な培地を添加し、蛍光顕微鏡を使用して写真を撮影します。
細胞固定液で細胞を室温で30分間固定する。その後、PBSで一度洗います。各ウェルに0.3%Triton-100を加え、室温で5分間インキュベートします。
PBSを2回洗浄した後、TUNEL検出作業溶液を各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で暗所で60分間インキュベートします。抗蛍光消光錠剤を含むDAPIを追加し、図示どおりに画像をキャプチャします。48ウェルプレートの各ウェルで、以前に培養した細胞の培地の半分を新しい培地と交換します。
mCherry GFP-LC3Bアデノウイルスとそれに続くポリブレンを加えて、感染効率を向上させます。24時間ごとに培地を交換してください。同時に共焦点顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を観察し、感染を確認します。
感染したら、原稿に記載されているように細胞を培養して捕獲します。以前に培養した細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定することから始め、0.1%Triton-100を加えます。次に、動物を含まないブロック溶液で細胞を1時間ブロックします。
次に、一次抗体とともに摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、蛍光二次抗体を細胞に加え、暗所で1時間インキュベートします。最後に、画像をキャプチャする前に、DAPI含有抗蛍光消光錠剤を追加します。
本研究では、クロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を有した。一方、200マイクロモルを超える濃度はH9C2細胞の増殖を阻害した。細胞生存率は過酸化水素処理後にかなり低下した。
しかし、クロセチンはこの変化をある程度逆転させました。過酸化水素処理後のROSレベルの上昇は、クロセチンによってある程度逆転した。蛍光結果はまた、クロセチンによるROSの減少を確認した。
また、クロセチン添加は過酸化水素処理によりミトコンドリア膜電位破綻を回復させた。同様に、アポトーシスもクロセチンによって逆転した。さらに、クロセチン前処理は、過酸化水素処理により誘導されたH9C2心筋細胞のオートファジーの流れを逆転させた。
クロセチン前処理はまた、過酸化水素処理によって誘発されるパーキンミトコンドリアの転座を減少させた。この手順に続いて、電子顕微鏡を使用してマイクロファージを直接観察することもでき、オートファゴソームに飲み込まれているミトコンドリアをより直感的に見ることができます。
