Este protocolo demuestra mediciones estándar, que reflejan la aptitud, en los mosquitos aedes aegypti, estos parámetros de aptitud se eligieron porque reflejan el éxito reproductivo, son fáciles de medir y se informan comúnmente en la literatura. Para empezar, coloque papeles de huevo en agua estéril durante la noche en el sector para incubar mosquitos transgénicos y de tipo silvestre. Permita que las larvas se alimenten ad libitum proporcionándoles varias gotas de lechada de alimento para peces molidos.
Para asegurarse de que los adultos sean vírgenes, separe las pupas por sexo una vez que emerjan, mueva la pupa a un portaobjetos de microscopio de vidrio y elimine el exceso de agua con un pañuelo para inmovilizar la pupa. Bajo un estereoscopio con un aumento de dos a cuatro veces, usando un pincel de punta fina, coloque la pupa boca arriba. A continuación, analice visualmente la cola en busca de diferencias en la forma del lóbulo genital.
Coloque las pupas macho y hembra en tazas de agua separadas en una contención adecuada. Para cruzar uno de genes de tipo salvaje o transgénicos o dos machos de tipo genético en masa con hembras vírgenes de tipo salvaje, agregue mosquitos anestesiados en proporciones de cinco machos por hembra en cartones de mosquitos que contengan aproximadamente 150 mosquitos. Después de dos o tres días, proporcione una fuente de sangre en la jaula para alimentar a las hembras siguiendo las prácticas de cría estándar.
Separe las hembras alimentadas con sangre de las hembras no alimentadas examinando visualmente sus abdómenes en busca de congestión y descartando las no alimentadas parcialmente, alimentadas y los machos. Vuelva a colocar a las hembras hinchadas en sus respectivas jaulas. Después de dos o tres días, coloque las hembras individuales en tubos cónicos de 50 mililitros forrados con papel de filtro preetiquetado con lápiz.
Llena todos los tubos con cinco mililitros de agua del grifo. Coloque un pequeño trozo de pasas o una bola de algodón empapada en azúcar en cada tubo cónico. Deje a las hembras en el sector durante uno o dos días y déjelas ovipositar.
Luego cuente el número de huevos en cada papel y calcule la fecundidad promedio, como el número de huevos contados en cada papel dividido por el número de hembras examinadas. Para secar los papeles de huevo, drene el agua de los tubos y vuelva a colocarlos en el interior. Para congelar las hembras alimentadas con sangre del estudio de fecundidad completado, coloque las jaulas de mosquitos a menos 20 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos.
Disecciona el ala izquierda de cada mosquito, extirpando la articulación del ala y el tórax y quitando todo el ala. Con pinzas, coloque el ala plana sobre un portaobjetos de vidrio, luego agregue una gota de la solución madre de 15 mililitros que comprende 70% de etanol y una gota de jabón para platos al ala en el portaobjetos usando una pipeta de transferencia. A continuación, agregue una gota de glicerol al 80% al cubreobjetos y colóquelo encima del ala en la solución de jabón de etanol.
Fotografía las alas montadas en los toboganes con una cámara con una lente de 65 milímetros. Utilice el software TpsDig para identificar coordenadas cartesianas bidimensionales para los puntos de referencia. Calcule la longitud y el área del ala utilizando el alfabeto R proporcionado en el manuscrito.
Calcule el tamaño del centroide del ala, que es una medida del tamaño, estadísticamente independiente de la forma definida como la raíz cuadrada de la suma de las distancias cuadradas de cada punto de referencia desde el punto central del ala Eclosionar huevos F1 individuales de los papeles recolectados de hembras individuales en recipientes de polipropileno transparente que contienen 100 mililitros de agua desionizada recién esterilizada. A los dos o tres días después de la eclosión, retire los papeles de huevo del agua y déjelos secar durante la noche. Vuelva a incubar los papeles de huevo en los mismos recipientes en los que se incubaron inicialmente.
De tres a cinco días después de la eclosión inicial, inspeccione visualmente las larvas en busca de un marcador transgénico. Registrar el número de larvas transgénicas positivas o negativas. Deseche las larvas negativas.
Calcule la fertilidad como el número de larvas transgénicas o de control dividido por el número total de huevos. Para determinar la proporción de sexos, agregue el número de hembras o el número de machos recolectados a lo largo de la línea de tiempo del estudio por mosquito hembra adulto individual. Divida este número por el número de pupas recolectadas para la misma línea de mosquitos generada por una sola hembra.
Para determinar la viabilidad de las larvas, agregue el número total de pupas recolectadas a lo largo de la línea de tiempo del estudio por mosquito hembra adulta. Divida este número por el número de larvas contadas por mosquito hembra adulto individual para la misma línea contada anteriormente. Calcule el desarrollo de larvas a pupas como el tiempo promedio hasta el desarrollo de la pupa después de la eclosión.
Para determinar la contribución de los machos, cruce 50 machos transgénicos o de control con 100 hembras de control en cajas de 64 onzas para que haya 50 machos con 100 hembras. Después del apareamiento, ofrezca a los mosquitos una comida de sangre, siguiendo las prácticas estándar de cría. A continuación, separe las hembras individuales completamente congestionadas en tubos cónicos de 50 mililitros forrados con papel de filtro blanco preetiquetado.
Deje a las hembras durante uno o dos días en el sector y déjelas ovipositar. Deje que los papeles se sequen en tubos en el sector durante al menos cinco días. Use fórceps para quitar los papeles y colóquelos para incubar.
A los dos o tres días después de la eclosión, retire los papeles de huevo del agua y déjelos secar. Vuelva a incubar los papeles de huevo en los mismos recipientes. De tres a cinco días después de la eclosión inicial, inspeccione visualmente las larvas en busca de un marcador transgénico.
Calcule la contribución masculina como el número de larvas transgénicas F2 dividido por el número de larvas totales por línea de mosquitos. Transfiera 50 mosquitos machos y 50 hembras de tipo silvestre o transgénicos de edad compartida que no se alimenten con sangre a un recinto adecuado. Lleve un registro del número de mosquitos machos y hembras muertos cada día.
Calcule la longevidad como el número promedio de días que pasaron antes de que los mosquitos murieran en las jaulas, omitiendo los mosquitos que mueren por causas no informativas. Las larvas a las pupas adultas y las pupas a los tiempos de desarrollo de las adultas se evaluaron con un ANOVA de Kruskal-Wallis y comparaciones post hoc de Dunn. Los mosquitos machos de tipo salvaje tuvieron un tiempo de pupación más corto que las hembras de tipo salvaje, mientras que los machos D7L1 no difirieron significativamente en su tiempo de pupa en relación con las hembras D7L1.
Las hembras D7L1 tardaron más en alcanzar la pupación que las hembras de tipo salvaje, al igual que los machos D7L1, en relación con los machos de tipo salvaje. Con respecto al tiempo de desarrollo de las pupas a los adultos, las hembras de tipo salvaje y D7L1 no difirieron significativamente, los machos de tipo salvaje pupan más rápido que las hembras de tipo salvaje y los machos D7L1. Los mosquitos hembra de tipo salvaje nunca alcanzaron su tiempo medio de supervivencia durante el estudio.
Todos los demás grupos alcanzaron su mediana de supervivencia antes de los 40 días, con una clara separación temporal de la mediana de supervivencia. Los mosquitos knockout D7L1 tenían un área de ala significativamente más pequeña que sus contrapartes de tipo salvaje, pero no hubo diferencias en el tamaño de las alas o el centroide. Los mosquitos que albergaban una copia de un casete de impulsores genéticos bajo la expresión de los promotores nanos o ZPG no tenían una aptitud significativamente diferente en comparación con la línea de visión ancha de Higgs, con la notable excepción de la viabilidad de las larvas.
Los datos de aptitud física recopilados aquí se pueden utilizar en aplicaciones posteriores, como el modelado matemático. Para los estudios que evalúan nuevas estrategias de control genético, serían necesarios estudios de jaulas más grandes en condiciones de semicampo después de los estudios de aptitud para habilidades pequeñas descritos aquí. Los estudios de aptitud física en el laboratorio ayudan a identificar los efectos no deseados de los genes knockouts o knockins.
La eliminación de una proteína salival puede inducir estrés en el desarrollo, mientras que el impulso genético en los mosquitos impulsores genéticos uno y dos mostró tasas de supervivencia de larvas más bajas. La medición de la aptitud de los impulsores genéticos influyó fuertemente en su persistencia en la simulación de poblaciones después del modelado matemático.
