이 프로토콜은 aedes aegypti 모기의 체력을 반영하는 표준 측정을 보여주며, 이러한 적합성 매개변수는 번식 성공을 반영하고 측정이 간단하며 일반적으로 문헌에 보고되기 때문에 선택되었습니다. 우선, 곤충류의 멸균 물에 계란 종이를 하룻밤 동안 넣어 형질 전환 및 야생형 모기를 부화시킵니다. 유충이 갈은 물고기 음식 슬러리를 몇 방울 떨어뜨려 즉시 먹이를 먹을 수 있도록 합니다.
성체가 처녀인지 확인하려면 번데기가 나오면 성별에 따라 번데기를 분리하고 번데기를 유리 현미경 슬라이드로 옮기고 조직으로 과도한 물을 제거하여 번데기를 고정시킵니다. 끝이 가늘게 파인 붓을 사용하여 2배에서 4배까지 입체경으로 번데기의 얼굴을 위로 향하게 합니다. 그런 다음 생식기 모양의 차이를 찾기 위해 꼬리를 육안으로 분석합니다.
수컷과 암컷 번데기를 적절한 격리 하에 별도의 물컵에 넣으십시오. 야생형 또는 형질전환 유전자 드라이브 1명 또는 유전자 드라이브 2명의 수컷을 처녀 야생형 암컷과 대량으로 교배하려면, 약 150마리의 모기가 들어있는 모기통에 5마리의 수컷과 1마리의 암컷의 비율로 마취된 모기를 추가합니다. 2-3일 후, 표준 사육 방법에 따라 암컷에게 먹이를 줄 수 있도록 케이지에 혈액 공급원을 제공하십시오.
피를 먹인 암컷과 먹이를 먹지 않은 암컷을 구분하여 복부의 충혈 여부를 육안으로 검사하고 먹이를 주지 않은 암컷은 부분적으로, 먹이를 먹은 암컷, 수컷으로 버립니다. 충혈된 암컷을 각각의 우리에 다시 넣습니다. 2-3 일 후, 연필로 미리 라벨이 붙은 여과지로 안감을 댄 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 개별 암컷을 넣으십시오.
모든 튜브에 5ml의 수돗물을 채웁니다. 건포도나 설탕에 적신 면봉을 각 원뿔형 튜브에 놓습니다. 암컷을 1-2일 동안 곤충 속에 두고 산란할 수 있도록 합니다.
그런 다음 각 종이에 있는 난자의 수를 세고 각 종이에 세어진 난자의 수를 선별된 암컷의 수로 나눈 평균 생식력을 계산합니다. 달걀 종이를 말리려면 튜브에서 물을 빼내고 곤충에 다시 넣으십시오. 완료된 번식력 연구에서 피를 먹인 암컷을 얼리려면 모기장을 섭씨 영하 20도에서 약 15분 동안 놓습니다.
각 모기의 왼쪽 날개를 절개하여 날개 관절과 흉부를 절제하고 날개 전체를 제거합니다. 집게를 사용하여 날개를 유리 슬라이드에 평평하게 놓은 다음 전사 피펫을 사용하여 슬라이드의 날개에 70% 에탄올과 주방 세제 1방울로 구성된 15밀리리터 원액 한 방울을 추가합니다. 다음으로, 커버 슬립에 80% 글리세롤 한 방울을 넣고 에탄올 비누 용액의 날개 위에 놓습니다.
65mm 렌즈가 장착된 카메라를 사용하여 슬라이드에 장착된 날개를 촬영합니다. TpsDig 소프트웨어를 사용하여 랜드마크에 대한 2차원 데카르트 좌표를 식별합니다. 원고에 제공된 R 스크립트를 사용하여 날개 길이와 면적을 계산합니다.
날개의 중심점에서 각 랜드마크의 제곱 거리의 합으로 정의된 모양의 제곱근으로 정의된 모양과 통계적으로 독립적인 날개 중심 크기를 계산합니다. 독신 암컷에서 수집된 종이에서 개별 F1 알을 100ml의 갓 멸균된 탈이온수가 들어 있는 폴리프로필렌 투명 델리 용기에 부화시킵니다. 부화 후 2-3일이 지나면 물에서 달걀 종이를 제거하고 밤새 말리십시오. 달걀 종이를 처음에 부화한 동일한 용기에 다시 부화시킵니다.
초기 부화 후 3-5일이 지나면 유충에서 형질전환 마커가 있는지 육안으로 검사합니다. 양성 또는 음성 형질 전환 유충의 수를 기록합니다. 부정적인 유충을 버리십시오.
생식력은 형질전환 또는 대조군 유충의 수를 총 난자 수로 나눈 값으로 계산합니다. 성비를 결정하려면 개별 성인 여성 모기당 연구 타임라인 전반에 걸쳐 수집된 암컷 수 또는 수컷 수를 추가합니다. 이 숫자를 한 마리의 암컷에 의해 생성된 동일한 모기줄에 대해 수집된 번데기의 수로 나눕니다.
유충의 생존 가능성을 결정하려면 성인 암컷 모기 당 연구 타임라인 전반에 걸쳐 수집된 총 번데기 수를 추가합니다. 이 숫자를 이전에 계산된 동일한 라인에 대해 개별 성인 암컷 모기 당 계산된 유충 수로 나눕니다. 부화 후 번데기 발달까지의 평균 시간으로 유충에서 번데기까지의 발달 시간을 계산합니다.
남성의 기여도를 결정하려면 50 명의 형질 전환 또는 대조군 남성과 100 명의 대조군 여성을 64 온스 상자에 교배하여 100 명의 여성과 50 명의 남성이 있도록합니다. 짝짓기 후에는 표준 사육 관행에 따라 모기에게 혈액 식사를 제공하십시오. 그런 다음 완전히 충혈된 개별 암컷을 사전 라벨이 부착된 흰색 여과지로 라이닝된 50밀리리터 원추형 튜브로 분리합니다.
암컷을 곤충에 1-2일 동안 두고 산란을 허용하십시오. 종이를 곤충의 튜브에서 최소 5일 동안 건조시키십시오. 집게를 사용하여 종이를 제거하고 부화를 위해 놓습니다.
부화 후 2-3일이 지나면 물에서 알 종이를 제거하고 말리십시오. 같은 용기에 있는 달걀 종이를 다시 부화시킵니다. 초기 부화 후 3-5일이 지나면 유충에서 형질전환 마커가 있는지 육안으로 검사합니다.
수컷 기여도를 F2 형질전환 유충의 수를 모기선당 총 유충의 수로 나눈 값으로 계산합니다. 50마리의 수컷과 50마리의 암컷 야생형 또는 형질전환 연령이 일치하는 비혈액 공급 모기를 적절한 인클로저로 옮깁니다. 매일 죽은 수컷 및 암컷 모기의 수를 추적합니다.
모기가 우리 전체에서 죽기까지 평균 일수로 수명을 계산하고 정보가 없는 원인으로 죽는 모기는 제외합니다. 유충에서 성체 번데기까지, 번데기에서 성충으로의 발달 시간은 Kruskal-Wallis'ANOVA 및 Dunn의 사후 비교로 평가되었습니다. 야생형 수컷 모기는 야생형 암컷보다 번데기 시간이 짧았으며, D7L1 1 수컷은 D7L1 암컷에 비해 번데기 시간이 유의하게 다르지 않았다.
D7L1 암컷은 야생형 암컷보다 번데기에 도달하는 데 더 오래 걸렸으며, D7L1 수컷도 야생형 수컷에 비해 더 오래 걸렸다. 번데기에서 성체까지의 발달 시간에 관해서는 야생형과 D7L1 암컷은 유의한 차이가 없었으며, 야생형 수컷은 야생형 암컷과 D7L1 수컷보다 번데기가 더 빠르다. 야생형 암컷 모기는 연구 기간 동안 평균 생존 시간에 도달하지 못했습니다.
다른 모든 그룹은 40일 이전에 생존 중앙값에 도달했으며, 생존 기간 중앙값의 시간적 간격이 뚜렷했습니다. D7L1 녹아웃 모기는 야생형 모기보다 날개 면적이 훨씬 작았지만 날개 또는 중심 크기에는 차이가 없었습니다. 나노 또는 ZPG 프로모터의 발현 하에 유전자 드라이브 카세트의 사본 한 개를 품고 있는 모기는 유충 생존력의 현저한 예외를 제외하고는 힉스 와이드 아이 라인과 비교하여 유의하게 다른 적합성을 갖지 않았습니다.
여기에서 수집된 피트니스 데이터는 수학적 모델링과 같은 다운스트림 애플리케이션에서 사용할 수 있습니다. 새로운 유전자 제어 전략을 평가하는 연구의 경우, 여기에 설명된 소규모 기술 적합성 연구 이후에 반필드 조건에서 더 큰 케이지 연구가 필요합니다. 실험실에서의 적합성 연구는 유전자 knockout 또는 knockin의 의도하지 않은 영향을 식별하는 데 도움이 됩니다.
타액 단백질을 knock-off하는 것은 발달 스트레스를 유발할 수 있으며, 유전자 드라이브 1과 2 모기의 유전자 드라이브는 유충 생존율이 낮았습니다. 유전자 드라이브 적합성 측정은 수학적 모델링 후 모집단 시뮬레이션에서 유전자 구동 적합성의 지속성에 큰 영향을 미쳤습니다.
