Dieses Protokoll zeigt Standardmessungen, die die Fitness bei Aedes aegypti-Mücken widerspiegeln, diese Fitnessparameter wurden ausgewählt, weil sie den Fortpflanzungserfolg widerspiegeln, einfach zu messen sind und in der Literatur häufig berichtet werden. Legen Sie zunächst Eierpapier über Nacht in steriles Wasser in den Insektor, um transgene und Wildtyp-Mücken zu schlüpfen. Lassen Sie die Larven nach Belieben fressen, indem Sie einige Tropfen gemahlene Fischfuttergülle geben.
Um sicherzustellen, dass die Erwachsenen Jungfrauen sind, trennen Sie die Puppen nach Geschlecht, sobald sie schlüpfen, legen Sie die Puppe auf einen Glasobjektträger und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einem Taschentuch, um die Puppe ruhig zu stellen. Unter einem Stereoskop mit zwei- bis vierfacher Vergrößerung und einem feinen Pinsel die Puppe mit der Vorderseite nach oben positionieren. Analysieren Sie dann visuell den Schwanz auf Unterschiede in der Form des Genitallappens.
Setzen Sie männliche und weibliche Puppen in getrennte Wasserbecher in geeigneter Haltung. Um Wildtyp- oder transgenen Gene Drive eines oder zwei Männchen in Massen mit jungfräulichen Wildtyp-Weibchen zu kreuzen, geben Sie anästhesierte Mücken im Verhältnis von fünf Männchen zu einem Weibchen in Mückenkartons mit etwa 150 Mücken. Stellen Sie nach zwei bis drei Tagen eine Blutquelle im Käfig bereit, um die Weibchen nach den üblichen Aufzuchtpraktiken zu füttern.
Sortieren Sie die mit Blut gefütterten Weibchen von den nicht gefütterten Weibchen, indem Sie ihren Bauch visuell auf Schwellungen untersuchen und die nicht gefütterten, teilweise gefütterten und männlichen Weibchen entsorgen. Setzen Sie die vollgestopften Weibchen wieder in ihre jeweiligen Käfige ein. Nach zwei bis drei Tagen legen Sie einzelne Weibchen in konische 50-Milliliter-Röhrchen, die mit Filterpapier ausgekleidet und mit Bleistift vorbeschriftet sind.
Füllen Sie alle Tuben mit fünf Millilitern Leitungswasser. Lege ein kleines Stück Rosinen oder Zucker getränkten Wattebausch auf jede konische Röhre. Lassen Sie die Weibchen ein bis zwei Tage im Insektory und lassen Sie sie eiablegen.
Zählen Sie dann die Anzahl der Eier auf jedem Papier und berechnen Sie die durchschnittliche Fruchtbarkeit, indem Sie die Anzahl der auf jedem Papier gezählten Eier durch die Anzahl der gesiebten Weibchen dividieren. Um das Eierpapier zu trocknen, lassen Sie Wasser aus den Schläuchen ab und geben Sie sie wieder in den Ei. Um die blutgefütterten Weibchen aus der abgeschlossenen Fruchtbarkeitsstudie einzufrieren, stellen Sie die Mückenkäfige für etwa 15 Minuten bei minus 20 Grad Celsius auf.
Präparieren Sie den linken Flügel jeder Mücke, indem Sie das Gelenk des Flügels und des Brustkorbs herausschneiden und den gesamten Flügel entfernen. Legen Sie den Flügel mit einer Pinzette flach auf einen Objektträger und geben Sie dann mit einer Transferpipette einen Tropfen der 15-Milliliter-Stammlösung aus 70 % Ethanol und einen Tropfen Spülmittel auf den Flügel auf dem Objektträger. Geben Sie anschließend einen Tropfen 80%iges Glycerin auf den Deckslip und geben Sie ihn auf den Flügel in die Ethanolseifenlösung.
Fotografieren Sie die auf den Dias montierten Flügel mit einer Kamera mit einem 65-Millimeter-Objektiv. Verwenden Sie die TpsDig-Software, um zweidimensionale kartesische Koordinaten für die Landmarken zu identifizieren. Berechnen Sie die Flügellänge und -fläche mit dem im Manuskript bereitgestellten R-Skript.
Berechnen Sie die Flügelschwerpunktgröße, die ein Maß für die Größe ist, statistisch unabhängig von der Form, definiert als die Quadratwurzel der Summe der Quadratabstände jedes Orientierungspunkts vom Mittelpunkt des Flügels. Schlüpfen Sie einzelne F1-Eier aus den von einzelnen Weibchen gesammelten Papieren in durchsichtige Feinkostbehälter aus Polypropylen mit 100 Millilitern frisch sterilisiertem entionisiertem Wasser. Zwei bis drei Tage nach dem Schlüpfen nehmen Sie die Eipapiere aus dem Wasser und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Schlüpfen Sie das Eierpapier in denselben Behältern wieder aus, in denen es ursprünglich geschlüpft ist.
Drei bis fünf Tage nach dem ersten Schlüpfen untersuchen Sie die Larven visuell auf einen transgenen Marker. Notieren Sie die Anzahl der positiven oder negativen transgenen Larven. Entsorgen Sie die negativen Larven.
Berechnen Sie die Fertilität als Anzahl der transgenen Larven oder Kontrolllarven dividiert durch die Gesamtzahl der Eier. Um das Geschlechterverhältnis zu bestimmen, addieren Sie die Anzahl der Weibchen oder die Anzahl der Männchen, die über den Studienzeitraum pro einzelner erwachsener weiblicher Mücke gesammelt wurden. Teilen Sie diese Zahl durch die Anzahl der Puppen, die für dieselbe Mückenlinie gesammelt wurden, die von einem einzelnen Weibchen erzeugt wurde.
Um die Lebensfähigkeit der Larven zu bestimmen, addieren Sie die Gesamtzahl der Puppen, die im Studienzeitraum pro erwachsener weiblicher Mücke gesammelt wurden. Teilen Sie diese Zahl durch die Anzahl der Larven, die pro einzelner erwachsener weiblicher Mücke für dieselbe zuvor gezählte Zeile gezählt wurden. Berechnen Sie die Entwicklung der Larven bis zur Puppe als die durchschnittliche Zeit bis zur Entwicklung der Puppe nach dem Schlüpfen.
Um den männlichen Beitrag zu bestimmen, kreuzen Sie 50 transgene oder Kontrollmännchen mit 100 Kontrollweibchen in 64-Unzen-Kartons, so dass es 50 Männchen mit 100 Weibchen gibt. Bieten Sie den Mücken nach der Paarung eine Blutmahlzeit an, indem Sie den üblichen Aufzuchtpraktiken folgen. Trennen Sie dann einzelne, vollständig geschwollene Weibchen in konische 50-Milliliter-Röhrchen, die mit vorbeschriftetem weißem Filterpapier ausgekleidet sind.
Lassen Sie die Weibchen ein bis zwei Tage im Insektory und lassen Sie sie eiablegen. Lassen Sie die Papiere mindestens fünf Tage lang in Röhrchen im Innenbereich trocknen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Papiere zu entfernen und zum Schlüpfen zu platzieren.
Zwei bis drei Tage nach dem Schlüpfen nehmen Sie die Eipapiere aus dem Wasser und lassen Sie sie trocknen. Die Eierpapiere in den gleichen Behältern wieder ausbrüten. Drei bis fünf Tage nach dem ersten Schlüpfen untersuchen Sie die Larven visuell auf einen transgenen Marker.
Berechnen Sie den männlichen Beitrag als Anzahl der transgenen F2-Larven dividiert durch die Anzahl der Gesamtlarven pro Mückenlinie. Bringen Sie 50 männliche und 50 weibliche Wildtyp- oder transgene altersangepasste Mücken, die nicht mit Blut gefüttert werden, in ein geeignetes Gehege. Verfolgen Sie die Anzahl der toten männlichen und weiblichen Mücken pro Tag.
Berechnen Sie die Langlebigkeit als die durchschnittliche Anzahl der Tage, die vergehen, bevor Mücken in den Käfigen sterben, wobei Mücken, die an nicht informativen Ursachen sterben, ausgeschlossen werden. Die Entwicklungszeit von Larven zu adulten Puppen und von Puppen zu adulten Puppen wurde mit einer Kruskal-Wallis'ANOVA und Dunns Post-hoc-Vergleichen bewertet. Männliche Wildtyp-Mücken hatten eine kürzere Zeit bis zur Verpuppung als Wildtyp-Weibchen, während sich die Männchen von D7L1 nicht signifikant in ihrer Verpuppungszeit im Vergleich zu den D7L1-Weibchen unterschieden.
D7L1-Weibchen brauchten länger bis zur Verpuppung als Wildtyp-Weibchen, ebenso wie D7L1-Männchen im Vergleich zu Wildtyp-Männchen. Hinsichtlich der Puppe zur adulten Entwicklungszeit unterschieden sich Wildtyp- und D7L1-Weibchen nicht signifikant, Wildtyp-Männchen verpuppen sich schneller als Wildtyp-Weibchen und D7L1-Männchen. Weibliche Wildtyp-Mücken erreichten während der Studie nie ihre mediane Überlebenszeit.
Alle anderen Gruppen erreichten ihr medianes Überleben vor 40 Tagen, mit einer deutlichen zeitlichen Trennung der medianen Überlebenszeiten. D7L1-Knockout-Mücken hatten eine signifikant kleinere Flügelfläche als ihre Wildtyp-Artgenossen, aber es gab keine Unterschiede in der Flügel- oder Schwerpunktgröße. Mücken, die eine Kopie einer Gene-Drive-Kassette unter Expression der Nanos- oder ZPG-Promotoren beherbergten, zeigten keine signifikant unterschiedliche Fitness im Vergleich zur Higgs-Wide-Eye-Linie, mit der bemerkenswerten Ausnahme der Lebensfähigkeit der Larven.
Die hier gesammelten Fitnessdaten können in nachgelagerten Anwendungen wie der mathematischen Modellierung genutzt werden. Für Studien zur Evaluierung neuartiger genetischer Bekämpfungsstrategien wären größere Käfigstudien unter Halbfeldbedingungen erforderlich, nachdem die hier beschriebenen Fitnessstudien mit kleinen Fertigkeiten durchgeführt wurden. Fitnessstudien im Labor helfen, unbeabsichtigte Wirkungen von Gen-Knockouts oder Knockins zu identifizieren.
Das Ausschalten eines Speichelproteins kann Entwicklungsstress induzieren, während der Gene Drive bei Gene Drive eins und zwei Mücken niedrigere Überlebensraten der Larven zeigte. Die Messung der Fitness von Gene Drives beeinflusste stark ihre Persistenz bei der Simulation von Populationen nach mathematischer Modellierung.
