富集分枝杆菌的天然和重组细胞外囊泡

富集分枝杆菌 EV 有助于描述其内容、破译其派系和日期，设计构建和生成主要利用候选疫苗的重组 EV 的方法。六个系列从细菌表面的不同位置产生。它们没有保守的标记。

因此，任何基于亲和力的方法都只能丰富 EV 的子集。相比之下，我们的方法捕获了所有生成的分枝杆菌EV。演示该程序的将是来自我实验室的博士生Mohd Ilyas。

首先，将一毫升野生型或重组耻垢分枝杆菌的甘油原液加入含有 10 毫升预热 7H9 肉汤的 50 毫升离心管中。盖上盖子并旋转试管，然后在 37 摄氏度下以 200 至 220 RPM 的转速孵育培养物过夜。第二天，当600纳米的光密度达到大约1时，在室温下以3,200g离心培养物10分钟，并将上清液丢弃到液体丢弃容器中。

加入一毫升预热的 Sautons 培养基，轻轻重悬以获得均匀的悬浮液。使用 Sautons 培养基将体积补足至 10 毫升。再次离心并弃去上清液。

洗涤后，重悬细菌细胞。在 20 毫升预热的 Sautons 介质中，并测量 600 纳米的光密度。将所需体积的细菌悬浮液接种到含有 330 毫升 Sautons 培养基的一至两升锥形瓶中，并在 37 摄氏度下以 200 RPM 孵育，直到光密度达到 0.3。

第二天，如前所述洗涤细胞一次，并将沉淀重悬于含有 1/10 吐温 80 的 330 毫升 Sautons 中。将 50 毫升细胞悬液分配到六个一升烧瓶中，每个烧瓶含有 280 毫升预热的 Sautons，其中含有 1/10 吐温 80。将培养物在 37 摄氏度下以 200 RPM 孵育，直到光密度达到 2 至 2.5。

将两升中指数阶段培养物加入六个 400 毫升瓶中，并在 4 摄氏度下以 8， 000 G 离心 20 分钟。收集上清液和预冷的高压灭菌烧瓶或烧杯，并储存沉淀的等分试样用于分析程序。如果 EV 是 mCherry 的重组体，则颗粒是彩色的，如果它们是野生型的或非荧光蛋白的重组体，则为棕色。

通过0.45微米的处理过滤器过滤培养上清液，然后通过0.22微米的过滤器过滤以除去所有细菌痕迹。接下来，用 15 毫升 4， 000 G 的双蒸水在 4 摄氏度下预洗 30 千道尔顿的膜浓缩器 20 分钟。然后用 15 毫升预过滤的冷 Sautons 介质使用相同的条件洗涤，以去除所有微量的化学物质。

洗涤后，将15毫升过滤的培养上清液加入浓缩器中，并在4°C下以4， 000 G浓缩20分钟。将浓缩液转移到冷的 40 毫升 Oak Ridge 离心管或 50 毫升新鲜的 Falcon 离心管中。一旦整个两升培养滤液浓缩，将浓缩液转移到双重蒸馏、洗涤和预冷的 50 毫升聚丙烯离心管中，并进行两步离心。

首先在4,000 G，然后在15， 000 G.将离心浓缩物转移到预冷的38.5毫升超速离心管中，并在4摄氏度下以100,000 G旋转四个小时。将上清液收集在预冷的 50 毫升新鲜 Falcon 离心管中。将超速离心管倒置在新鲜的无绒吸收纸上，以去除微量上清液，并将沉淀重悬于600微升HEPES缓冲液中。

将重悬的沉淀分层在 13 毫升预冷的 UltraClear 聚丙烯超速离心管的底部，并与 4 毫升惰性 60% 密度梯度碘克沙醇溶液轻轻混合。然后用40%30%20%和10%碘克沙醇各覆盖一毫升。通过在顶部加入四毫升 6% 碘克沙醇来填充试管。

在玻璃烧杯或支架中仔细称量试管后，轻轻地将其转移到摆动桶中，然后转移到摆动桶转子中，在四摄氏度下以 141， 000 G 超速离心 16 小时。超速离心后，小心地取出试管并将一毫升馏分收集到高压灭菌的微量离心管中。透射电镜分析表明分枝杆菌EV是圆形的，纳米跟踪分析证实了直径在20至250纳米之间不同尺寸的EV。

当 mCherry 的 N 端平移融合到 CFP-29 的 C 端时，Msm 的一部分富集 mEV 变成粉红色，表明 cf-29 能够携带感兴趣的外源蛋白。然后使用 CFP-29 评估 EsxA 向 Msm EV 的交付。在 Msm EV 中观察到 Mtb 的 EsxA 数量很少。

CFP-29 EsxA 3X FLAGs更稳定，在mEVs中积累的水平更高。从生理不同条件下生长的分枝杆菌中富集 EV 可以深入了解其改变的内容和修饰的功能，这些功能决定了持续的感染性、发病机制和病原体传播。