O enriquecimento de EVs micobacterianos ajuda a delinear seu conteúdo, decifrar suas facções e datar o projeto de maneiras de construir e gerar EVs recombinantes que exploram principalmente candidatos a vacinas. Seis séries são geradas a partir de diferentes locais da superfície bacteriana. Não possuem marcadores conservados.
Assim, qualquer abordagem baseada em afinidade pode enriquecer apenas um subconjunto dos EVs. Em contraste, nosso método captura todas as EVs micobacterianas geradas. Quem demonstrará o procedimento será Mohd Ilyas, aluno de doutorado do meu laboratório.
Para começar, adicione um mililitro de glicerol de Mycobacterium smegmatis selvagem ou recombinante a um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 10 mililitros de caldo 7H9 pré-aquecido. Feche a tampa e gire o tubo antes de incubar a cultura durante a noite a 37 graus Celsius entre 200 e 220 RPM. No dia seguinte, quando a densidade óptica de 600 nanômetros atingir aproximadamente um, centrifugar a cultura a 3.200 G por 10 minutos à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante em um recipiente de descarte líquido.
Adicione um mililitro de meio Sautons pré-aquecido e ressuspenda suavemente para obter uma suspensão uniforme. Completar o volume para 10 mililitros usando meios Sautons. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante.
Após a lavagem, ressuspenda as células bacterianas. em 20 mililitros de meios Sautons pré-aquecidos e medir a densidade óptica a 600 nanômetros. Inocular o volume necessário de suspensão bacteriana num balão de Erlenmeyer de um a dois litros contendo 330 mililitros de meios Sautons e incubar a 37 graus Celsius em 200 RPM até que a densidade óptica atinja 0,3.
No dia seguinte, lave as células uma vez como demonstrado anteriormente e ressuspenda o pellet em 330 mililitros de Sautons contendo 1/10 Tween 80. Distribuir 50 mililitros da suspensão celular em seis frascos de um litro, cada um contendo 280 mililitros de Sautons pré-aquecidos contendo 1/10 Tween 80. Incubar as culturas a 37 graus Celsius em 200 RPM até que a densidade óptica atinja dois a 2,5.
Adicione dois litros de culturas de estágio médio exponencial a seis garrafas de 400 mililitros e centrífuga a 8.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Recolher o sobrenadante e os frascos autoclavados ou béqueres pré-refrigerados e armazenar uma alíquota do pellet para procedimentos analíticos. O pellet é colorido se os EVs forem recombinantes para mCherry e marrom se forem selvagens ou recombinantes para proteínas não fluorescentes.
Filtrar o sobrenadante da cultura através de um filtro de eliminação de 0,45 mícron, seguido de filtração através de um filtro de 0,22 mícron para remover todos os vestígios de bactérias. Em seguida, pré-lave os concentradores de membrana de 30 quilodalton com 15 mililitros de água bidestilada a 4.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave com 15 mililitros de meios Sautons frios pré-filtrados usando as mesmas condições para remover todos os vestígios de produtos químicos.
Após a lavagem, adicione 15 mililitros de sobrenadante cultivado filtrado em um concentrador e concentre a 4.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o concentrado para um tubo de centrífuga Oak Ridge frio de 40 mililitros ou um tubo de centrífuga Falcon fresco de 50 mililitros. Uma vez concentrados os dois litros inteiros do filtrado de cultura, transfira o concentrado para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros bidestilado, lavado e pré-resfriado e submetido a uma centrifugação em duas etapas.
Primeiro a 4.000 G, e depois a 15.000 G.Transfira o concentrado centrifugado para um tubo de ultracentrífuga pré-resfriado de 38,5 mililitros e gire a 100.000 G por quatro horas a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante num tubo de centrifugação Falcon fresco pré-refrigerado de 50 mililitros. inverter o tubo ultracentrífugo em um papel absorvente fresco e sem fiapos para remover vestígios do sobrenadante e ressuspender o pellet em 600 microlitros de tampão HEPES.
Coloque o pellet ressuspendido no fundo de um tubo ultracentrífugo de polipropileno UltraClear pré-resfriado de 13 mililitros e misture suavemente com quatro mililitros de solução inerte de iodixanol com gradiente de densidade de 60%. Em seguida, sobreponha com um mililitro cada de 40%30%20% e 10% de iodixanol. Encha o tubo adicionando quatro mililitros de iodixanol a 6% na parte superior.
Depois de pesar cuidadosamente o tubo em um copo de vidro ou um suporte, transfira-o suavemente para os baldes oscilantes e, em seguida, para o rotor de caçambas oscilantes para ultracentrifugação a 141.000 G por 16 horas a quatro graus Celsius. Após a ultracentrifugação, remova cuidadosamente o tubo e colete uma fração de um mililitro em tubos de microcentrífuga autoclavados. A análise de MET mostrou que os EVs micobacterianos são circulares e a análise de nano-tracking confirmou EVs de diferentes tamanhos com diâmetros variando entre 20 e 250 nanômetros.
Quando a extremidade N-terminal do mCherry foi translacionalmente fundida à extremidade C-terminal do CFP-29, uma porção dos mEVs enriquecidos de Msm tornou-se rosa, indicando a capacidade do cf-29 de transportar uma proteína estranha de interesse. CFP-29 foi então usado para avaliar a liberação de EsxA em EVs MSM. A EsxA de Mtb foi observada em EVs Msm em baixas quantidades.
CFP-29 EsxA 3X FLAG foi mais estável e acumulou em níveis mais elevados em mEVs. O enriquecimento dos EVs a partir de micobactérias cultivadas sob diferentes condições fisiológicas fornece informações sobre seu conteúdo alterado e funções modificadas que ditam a infectividade sustentada, a patogênese e a disseminação do patógeno.
